干细胞与组织工程 毛囊来源干细胞及其在组织工程皮肤中的研究现状

　　成体干细胞（adult stem cells）是一类存在于具有自我更新功能组织中的原始细胞，它具有高度增殖潜能和终生无限的自我更新能力，在细胞的生长和分化过程中起主导作用[1]。而毛囊的周期性生长提示毛囊结构中也存在着成体干细胞，称为毛囊干细胞。毛囊干细胞的应用途径有多种，组织工程皮肤便是其应用中充满前景的一条。组织工程皮肤的构建早已开始，开始是将角质形成细胞作为种子细胞[2]，其后又采用表皮干细胞为种子细胞构建了组织工程皮肤[3]，但构建的皮肤存在排异、供皮量有限、无法构建皮肤附属器等问题。由于毛囊干细胞具有多向分化的潜能，可构建包含皮肤附属器以及黑素细胞的皮肤，在临床应用前景更为广阔，已成为组织工程皮肤重点研究的种子细胞。
　　
　　1毛囊的结构
　　
　　毛囊是由表皮向下凹陷形成，由上至下分为漏斗部、峡部、茎部、球部四个部分，可发生周期性改变。由内至外分为上皮性毛根鞘和毛囊周围鞘两部分，两者之间有玻璃膜。上皮性毛根鞘起源于表皮，又分为外根鞘和内根鞘。外根鞘相当于表皮的基底层和棘细胞层，在峡部末端外毛根鞘细胞增殖，并且形成隆起，通常称其为隆突部。内根鞘由亨利层和赫胥黎层构成。
　　
　　2毛囊来源干细胞
　　
　　来源于毛囊中的成体干细胞称为毛囊来源干细胞。毛囊结构中包含有多种干细胞，如表皮干细胞、真皮干细胞、黑素干细胞等，它们各自的表明标志，组织定位，具体功能等都不尽相同。表皮干细胞(Epithelial stem cells)即我们研究最多的毛囊来源干细胞（后文简称毛囊干细胞），它的定位、表面标志及调控途径将在后文中作详细阐述。真皮干细胞(Dermal stem cells)毛囊真皮细胞最先被发现具有干细胞和组细胞特性是在对胡须的毛囊组织进行再生实验时发现的[4]。这类真皮干细胞主要存在于真皮乳头和真皮鞘中，在某种程度上来自这两处的细胞是可以互换的[5]。Reynolds等[6]从成人毛囊真皮中分离得到的细胞被发现具有诱导形成各种上皮细胞并进而形成毛囊结构的能力。还有研究人员通过标记的真皮细胞证实了皮肤中的真皮细胞在创伤后能够由毛囊的真皮细胞完全再生[7]。黑素细胞干细胞（Melanocyte stem cells），目前研究发现在毛发外毛根鞘中存在着处于某一分化阶段的黑素细胞干细胞[8]。也有实验证明了黑素干细胞的存在[9-10]。但目前为止，对于黑素干细胞还未发现特异的分子标记。近年有研究者发现Pax3和Mitf是控制黑素干细胞维持和分化的关键表面分子[11]。
　　
　　3毛囊干细胞的定位
　　
　　早期人们在毛球部发现该部分细胞分裂显著，故推测毛球是细胞分裂和毛囊生长期起始的重要部位，毛球部可能含有干细胞[12-13]。随着研究的深入，毛囊干细胞的众多特性被发现，慢周期性便是其中之一[1]。Cotsarelis等[14]使用3H-TdR对小鼠皮肤进行连续标记，4周后发现95％以上的毛囊隆突部细胞仍保持标记，从而提出了隆突激活假说（bulge activation hypothesis）。此后，Taylor等[3]采用Brdu和3H双标记滞留方法亦证实毛囊干细胞定位于上段的隆突区。Oshima等[15]利用转基因方法构建了表达β半乳糖苷酶的小鼠毛囊来证实毛囊干细胞定位于隆突部。虽然有大量的实验证实隆突部存在毛囊干细胞，但利用干细胞慢周期特性和毛囊生长周期特点对人毛囊进行体外分析发现，毛囊干细胞在胚胎期定位于隆突区，而在成人中，有部分毛囊干细胞还存在于毛囊下段隆突区以下的外根鞘中[16]，即毛囊中有两个干细胞库。故对毛囊干细胞的确切定位尚有争议。
　　
　　4毛囊干细胞表面标志
　　
　　毛囊干细胞的表面标志是分离、鉴定毛囊干细胞的重要依据。目前为止，毛囊干细胞尚缺乏具有高度特异性的表面标志，但近年来，利用各种标志和各种技术对毛囊干细胞进行分离取得了一些进展[17]，所发现的相对特异的表面标志有以下几个。
　　4.1 整合素：表皮干细胞表面常高表达某些介导干细胞与基底膜粘附的整合素，β1整合素便是现在认为毛囊干细胞存在的标志之一。对表皮基底层细胞的β1整合素进行标记后检测，发现表达β1整合素的细胞具有更高的克隆形成率[18]。近年还有研究发现表达α6整合素的细胞，通过与β4整合素的作用接和于基膜，这类细胞比表达β1整合素的细胞有更高的增殖潜能[19]。Kaur等[20]发现表皮基底层α6表达阳性、10G7表达阴性的细胞比β1表达阳性、10G7表达阴性的细胞具有更高的增殖潜能，预示整合素α6可能是比β1更好的分子标记。但尽管如此，β1整合素和α6整合素由于在某些不具有干细胞特性的细胞中也能高表达，仍不能认为是毛囊干细胞的特异性标志[21]。
　　4.2 CD34：CD34在鼠的毛囊隆突区的细胞中有表达[22]，而且表达CD34的细胞同时与标记滞留细胞一致，与CD34－细胞相比，CD34＋细胞表现出较强的增殖潜能, Raposio等[23]也利用免疫组化方法在毛囊处发现了表面标志CD34与Ki67。但是CD34在人毛囊结构中并没有表达[24-25]，并不能用来对人的毛囊干细胞进行分离。只是由于它是鼠毛囊干细胞中较好的表明标志，所以是用来研究毛囊干细胞的工具之一。
　　4.3 p63：p63转录因子是p53同源的肿瘤抑制基因，它与产生短暂增殖后裔的过程有关，是维持表皮基底角质形成细胞增生潜能必需的。Pellegrini等[26]通过在体外检查p63表达与克隆形成率，发现细胞的克隆形成率与p63的表达率呈正相关，因此将p63作为鉴定表皮干细胞的一种标志。但p63同样在毛间质细胞中高表达，而这种间质细胞是缺少增殖能力的[27]。因此p63作为毛囊干细胞的特异标记尚待商定。
　　4.4 角蛋白：角蛋白是一类最早用来定位表皮干细胞的标志，特别是K15和K19。对人头皮组织运用免疫组化方法检测发现人毛囊中细胞表达K15并与标记滞留细胞一致，而且K15不与增殖标记Ki-67发生免疫反应[28]，表明了K15是慢周期细胞的表面标志。K19也认为是毛囊干细胞的表面标志之一，一个主要的实验基础是表达K19的毛囊膨出区细胞正是标记滞留细胞的所在[29]。虽然K19也表达与隆突部细胞并且不存在于分裂活跃的细胞中，但它并不与K15共表达。K19在外根鞘的细胞中也有表达，特别是在外根鞘下三分之一的部分，该部分被认为可能是毛囊中干细胞除了隆突部以外的第二个贮存处。
　　4.5 其他标志：还有一些表面标志如CD71和CD200也被用来鉴定毛囊干细胞。CD71为干细胞表面的转铁蛋白受体，能被单抗10G7识别。Kaur等[20]发现10G7表达阳性的表皮细胞与1OG7表达阴性而α6和β1表达均阳性的表皮细胞相比具有更强的再生能力。Li等[19]从新生儿分离出α6表达阳性CD71表达阴性的细胞，具有长期分裂潜能和较高的克隆形成效率，且与标记滞留细胞共表达。这些结果都表明CD71作为毛囊干细胞表明标志的可能。研究表明CD200存在于毛囊隆突部细胞，并且在免疫和炎症调节方面起着重要的作用[30-31]。Ki67也被认为是细胞具有活跃周期的标志，并提示毛囊处于生长期[32]。
　　
　　5毛囊干细胞在组织工程皮肤中的研究及展望
　　
　　组织工程皮肤是目前唯一运用于临床的组织工程产品，目前表皮干细胞作为种子细胞构建的组织工程化皮肤已应用于临床烧伤患者[33]，但仍存排异或供皮量有限等问题。除此之外，现有的种子细胞构建的组织工程皮肤不含有皮肤附属器。但随着毛囊干细胞的出现以及研究的深入，组织工程皮肤有望解决上述的各种问题，研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力，并具有形成皮肤附属器的能力[14-15]。利用毛囊干细胞作为种子细胞可用于构建以下几个类型的组织工程皮肤。
　　5.1 构建含毛囊结构的组织工程皮肤:有研究发现，从成年生长期毛囊分离的毛乳头放于表皮附近可诱导形成新的毛囊[34]。Renolds等[35]移植头皮毛囊结缔组织后发现了新毛囊的形成。这类组织工程皮肤中包含毛囊结构，可以有毛发生长，从根本上解决了脱发问题，相较现在的各种毛发种植技术无疑有更大的优势,为某些棘手的皮肤、毛囊疾病带来了希望。
　　5.2 构建含黑素细胞的组织工程皮肤用于色素脱失疾病的治疗：皮肤色素脱失疾病，由于病因不清，尚无理想的单纯药物治疗方法。移植黑素细胞治疗色素脱失，有一定治疗效果，但也存在着治疗后色素深度不易控制、长期疗效不够稳定等问题。1971年，Falabela首次报道以自体表皮移植治疗白癜风获得成功,20世纪90年代，Falabella又以自体皮肤点状移植治疗白癜风获得成功。但是自体皮肤移植存在很大的局限：需大面积取皮，给患者带来新的创面和继发瘢痕。毛囊干细胞构建的组织工程皮肤无疑是治疗色素脱失的一条希望之路。1982年，美国学者Eisinger与Marko首先培养黑素细胞获得成功。目前研究发现有一类黑素细胞干细胞广泛分布于生长期外毛根鞘中[8]。很多实验都证实了黑素细胞干细胞的存在[9-10]。以毛囊来源干细胞作为细胞来源，实现人工皮肤替代物的构建并应用于临床色素脱失的治疗。这无疑拓展组织工程皮肤代用品的应用范围，提升了色素脱失的治疗水平。
　　5.3 构建含有汗腺、皮脂腺结构的组织工程皮肤:我们从毛囊干细胞增殖分化的调控中可以知道，当wnt信号被抑制时，毛囊干细胞便会向皮脂腺和表皮方向分化，因此构建含有皮脂腺结构的组织工程皮肤很有前景。皮脂腺结构可以更好地给皮肤提供油脂的润泽，防止皮肤的龟裂，为构建后的组织工程皮肤提供了更好的存活环境。虽然毛囊干细胞构建组织工程皮肤的前景美好，但尚存在一些问题有待解决，如干细胞的鉴定分离、毛囊干细胞体外培养时传代数短、短暂扩增细胞的获得以缩短干细胞的扩增时间、定向诱导毛囊干细胞的分化等。但随着人们对毛囊干细胞研究的深入及分子层面的研究加强，相信在不久的将来毛囊干细胞一定能定向构建出人们所希望的组织工程皮肤。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Lajtha LG. Stem cell concepts[J]. Differentiation,1979,14(1-2):23-34.
　　[2]Green H,Kehinde O,Thomas J.Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting[J].Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(11):5665-5668.
　　[3]Taylor G,Lehrer MS,Jensen PJ.Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis [J].Cell,2000,102(4):451-411.
　　[4]Oliver RF.Whisker growth after removal of the dermal papilla and lengths of follicle in the hooded rat[J].Embryol Exp Morphol,1966,15(3):331-347.
　　[5]James M,Waters,Gavin D,et al.Hair follicle stem cells[J].Seminars in Cell & Developmental Biology, 2007,18:245-254.
　　[6]Reynolds AJ,Jahoda CA.Cultured dermal papilla cells induce follicle formation and hair growth by transdifferentiation of an adult epidermis[J].Development,1992,115(2):587-593.
　　[7]Gharzi A,Reynolds AJ,Jahoda CA.Plasticity of hair follicle dermal cells in wound healing and induction[J].Exp Dermatol,2003,12(2):126-136.
　　[8]Tobin DJ,Bystryn JC.Different populations of melanocytes are present in hair follicles and epidermis[J]. Pigment Cell Res,1996,9(6):304-310.
　　[9]Botchkareva NV,Khlgatian M,Longley BJ,et al.SCF/c-kit signaling is required for cyclic regeneration of the hair pigmentation unit[J].FASEB,2001,15(3):645-658.
　　[10]Rawls JF,Johnson SL.Zebrafish kit mutation reveals primary and secondary regulation of melanocyte development during fin stripe regeneration[J].Development,2000,127(17):3715-3724.
　　[11]Eiríkur Steingrímsson,Neal G,Nancy A,et al.Melanocyte Stem Cell Maintenance and Hair Graying[J].Cell, 2005,121(1):9-12.
　　[12]Kligman AM.The human hair cycle[J].J Invest Dermatol,1959,33:307-316.
　　[13]Pinkus H.Epithelial-esodermal interaction in normal hair growth, alopecia, and neoplasia[J].J Dermatol 1978,5(3):93-101.
　　[14]Cotsarelis G，Lavker RM．Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit：implication for follicular stem cell，hair cycle，and skin carcinogenesis [J].Cell,1990,61(7)：1329-1337.
　　[15]Oshima H,Rochat A，Kedzia C,et a1．Morphogenesis and renewal of hair follicle from adult muhipotene stem cells[J].J Cell,2001,104(2)：233-245.
　　[16]Commo S，Galliard O，Bernard BA.The human hair follicle contains two distinct K19 positive compartments in the outer root sheath：a unifying hypothesis for stem cell reservoir[J]? Differentiation, 2000,66(4-5)：157-164.
　　[17]Manabu Ohyama.Hair follicle bulge: A fascinating reservoir of epithelial stem cells[J].J Dermatol Sci,2007,46(2):81-89.
　　[18]Jones PH,Watt FM.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression [J].Cell,1993,73(4):713-724.
　　[19]Li A,Simmons PJ,Kaur P.Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,95(7):3902-3907.
　　[20]Kaur P.Interfollicular epidermal stem cells: identification,challenges,potential[J].Invest Dermatol, 2006,126(7):1450-1458.
　　[21]Janes SM,Lowell S,Hutter C.Epidermal stem cells[J].Pathol,2002,197(4):479-491.
　　[22]Trempus CS,Morris RJ,Bortner CD,et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34[J].Invest Dermatol,2003,120(4):501-511.
　　[23]Raposio E,Guida C,Baldelli I,et al.Characterization of multipotent cells from human adult hair follicles[J].Toxicology in Vitro,2007,21(2):320-323.
　　[24]Ohyama M,Terunuma A,Tock CL,et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].Clin Invest,2006,116(1):249-260.
　　[25]Cotsarelis G.Gene expression profiling gets to the root of human hair follicle stem cells[J].Clin Invest,2006,116(1):19-22.
　　[26]Pellegrini G,Dellambra E,Golisano O,et al.P63 identifies keratinocyte stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2001,98(6):3156-3161.
　　[27]Tsujita-Kyutoku M,Kiuchi K,Danbara N,et al.P63 expression in normal human epidermis and epidermal appendages and their tumors[J].J Cutan Pathol,2003,30(1):11-17.
　　[28]Lyle S,Christofidou-Solomidou M,Liu Y,et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells [J].Cell,1998,111( Pt 21):3179-3188.
　　[29]Commo S,Gaillard O,Bernard BA.The human hair follicle contains two distinct K19 positive compartments in the outer root sheath: a unifying hypothesis for stem cell reservoir[J]? Differentiation,2000,66(4-5):157-164.
　　[30]Rosenblum MD,Olasz EB,Yancey KB,et a1．Expression of CD on epithelial cells of the murine hair follicle：a role in tissue-specific immune tolerance [J].Invest Dermatol,2004,123(5):880-887.
　　[31]Rosenblum MD,Yancey KB,Olasz EB,et al.CD200, a "no danger" signal for hair follicles[J].J Dermatol Sci,2006,41(3):165-174.
　　[32]Raposio E,Guida C,Baldelli I,et al.Characterization of multipotent cells from human adult hair follicles[J].Toxicology in Vitro,2007,21(2):320-323.
　　[33]Gallico GGI,O"Connor NE,Compton CC,et al.Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium[J].J New England Med,1984,311(7):448-451.
　　[34]Kurt S Stenn,George Cotsarelis.Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology[J].Current Opinion in Biotechnology,2005,16(5):493-497.
　　[35]Reynolds AJ,Lawrence C,Cserhalmi-Friedman PB,et al.Trans-gender induction of hair follicles[J].Nature, 1999,402(6757):33-34.
　　
　　[收稿日期]2008-04-07 [修回日期]2008-06-03
　　编辑/李阳利