内质网分子伴侣GRP94\GRP78和XBP1在病理性瘢痕中的表达初探:内质网标志性分子伴侣

　　[摘要]目的:检测内质网应激反应的关键分子葡萄糖调节蛋白94(GRP94)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和X-盒结合蛋白1(XBP1)mRNA在病理性瘢痕的表达,探讨其基因表达及内质网应激反应与病理性瘢痕形成及转归的关系。方法:用RT-PCR法检测GRP94、GRP78和XBP1 mRNA在:①瘢痕疙瘩(13例)、增生性瘢痕(17例)和正常皮肤(15例)组织以及体外培养的瘢痕疙瘩(5例)、增生性瘢痕(5例)和正常皮肤(6例)成纤维细胞中的表达;②体外培养瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纤维细胞(各5例)中经0.1mg/ml氢化可的松作用前后的表达。结果:①GRP94、GRP78和XBP1 mRNA在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤组织及其成纤维细胞中的表达均无显著性差异(P>0.05);②0.1mg/ml氢化可的松作用后,GRP94 mRNA在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕来源的成纤维细胞中的表达量均显著下降,具有统计学意义(P0.05)。结论:内质网分子伴侣GRP94、GRP78和XBP1在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织及其成纤维细胞中基因转录与正常皮肤组织及其成纤维细胞中基因转录水平一致; GRP94 mRNA的表达量显著下降可能是糖皮质激素治疗病理性瘢痕的机制之一。
　　[关键词]葡萄糖调节蛋白94;葡萄糖调节蛋白78;X-盒结合蛋白1;瘢痕
　　[中图分类号]Q591.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)03-0358-03
　　
　　A preliminary study on the expression of endoplasmic reticulum chaperone GRP94、GRP78 and XBP1 in pathologic scar
　　NIE Fang-fei,QIN Ze-lian,CHEN Dong-ming,ZHAO Xia
　　(Department of Plastic Surgery,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China)
　　
　　Abstract: ObjectiveTo detect the expression of glucose regulated protein 94(GRP94),glucose regulated protein 78(GRP78) and X-box binding protein 1(XBP1), which are key molecules in endoplasmic reticulum stress,in pathologic scar,and to explore the association between their expression and pathologic scar. Methods The samples consisted of three kinds of tissues,which were keloid,hypertrophic scar and normal skin. Fibroblasts were derived from the samples and cultured in vitro.Hydrocortisone in 0.1mg/ml concerntration was administrated to the fibroblasts derived from keloid and hypertrophic scar. RT-PCR was used to assess the mRNA expression levels of the aimed genes in tissue samples and fibroblasts.Results No significant differences were detected on GRP94,GRP78 or XBP1 mRNA levels in tissues or fibroblasts among the three groups: keloid,hypertrophic scar and normal skin.GRP94 mRNA levels were lessened remarkably in each fibroblast sample after being treated with hydrocortisone,while the changes of GRP78 and XBP1 mRNA levels were irregular.ConclusionsThere are no significant differences in GRP94、GRP78 or XBP1 mRNA levels among keloid, hypertrophic scar and normal skin tissues or fibroblasts. Downregulation of GRP94 mRNA expression may be one of the mechanisms for glucocorticoid hormones to treat pathologic scar.
　　Key words: glucose regulated protein 94; glucose regulated protein 78; X-box binding protein 1; scar
　　
　　病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩和增生性瘢痕,是整形外科面临的难题之一。以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征,其发病机制与免疫、炎症、细胞增殖/凋亡失衡等多种因素相关[1]。研究表明,病理性瘢痕局部可能存在缺氧、氧自由基、钙离子失衡、内质网中分泌蛋白超负荷等微环境因素[2-3]。而细胞内钙失稳态、大量氧自由基和未折叠或错误折叠蛋白质在内质网的蓄积可以引发内质网应激, 其标志为内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)、葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein 94, GRP94)等的转录上调和X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)mRNA的剪切等[4]。内质网分子伴侣还参与了内质网中蛋白质的合成和分泌;与免疫、炎症和细胞凋亡等细胞生物学行为关系密切[5-7],因此,笔者推测病理性瘢痕组织局部可能存在内质网应激反应。本实验检测病理性瘢痕组织及其来源的成纤维细胞中内质网分子伴侣GRP94、GRP78和XBP1 mRNA的表达,有助于明确内质网应激以及上述内质网分子伴侣与病理性瘢痕发病及转归机制的联系。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 实验标本:所用标本主要来自北京大学第三医院成形外科门诊及病房手术的患者,少数来自北京积水潭医院烧伤整形科患者。瘢痕标本为切除的病变组织,正常皮肤为美容手术或植皮术弃用的皮肤。所有取材均获得患者知情同意。组织标本在离体后切成小块,液氮冻存;或立即置于培养液中用于细胞培养。
　　1.1.2 主要试剂及仪器:DMEM培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(美国HyClone公司)、氢化可的松注射液(北京双鹤药业股份有限公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC,美国Sigma公司)、组织及细胞RNA提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)。凝胶成像及分析系统(英国Syngene公司)。
　　1.1.3 基因引物:目的基因及内参基因GAPDH 的引物序列均引自文献[8-10], 由上海生工生物工程公司合成。引物序列分别是:GRP94上游5′- CAG TTT TGG ATC TTG CTG TGG -3′,GRP94下游5′- CAG CTG TAG ATT CCT TTG C -3′, 扩增片段长度为270bp;GRP78上游5′- CTG GGT ACA TTT GAT CTG ACT GG -3′,GRP78下游5′- GCA TCA TGG TGG CTT TCC AGC CAT TC -3′,扩增片段长度为398bp;XBP1上游5′- CCT TGT GTA GTT GAG AAC CAG G -3′,XBP1下游5′- GGG GCT TGG TAT ATA TGT GG -3′,扩增片段长度为442bp(mRNA被剪切前)或416bp(mRNA被剪切后);GAPDH上游5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT CA-3′,GAPDH下游5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′,扩增片段长度为250bp。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1细胞培养及处理:采用组织块培养法进行成纤维细胞的原代培养。待细胞几乎长满成致密单层后,用0.25%胰蛋白酶消化,传代。实验所用成纤维细胞为第2～5代细胞。
　　细胞约80%融合时给予氢化可的松,同时设未给药组;96h后,提取细胞总RNA。
　　1.2.2 RT-PCR法检测目的基因的表达量:取适量液氮冻存的组织,提取总RNA;每例细胞标本取2×106个成纤维细胞,加1mlTrizol 试剂提取细胞总RNA。取等量的RNA,反转录成cDNA,加入PCR试剂进行PCR反应,取8μl PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像分析系统扫描凝胶中各条带紫外光吸收量(Vol)。目的基因Vol值与相应内参Vol值的比值代表每个样本目的基因的相对表达量。
　　1.3 统计学处理:采用SPSS11.0统计学软件分析,所有数据以均数±标准差表示。以单因素方差分析(ANOVA)检验三组间差异;以配对t检验分析给药细胞与对照细胞的基因表达差异,P 　　[6]Clauss IM, Chu M, Zhao JL,et al. The basic domain/leucine zipper protein hXBP-1 preferentially binds to and transactivates CRE-like sequences containing an ACGT core[J]. Nucleic Acids Res,1996,24(10):1855-1864.
　　[7]Vabulas RM, Braedel S, Hilf N, et al.The endoplasmic reticulum-resident heat shock protein Gp96 activates dendritic cells via the Toll-like receptor 2/4 pathway[J]. J Biol Chem,2002,277(23):20847-20853.
　　[8]Wang Q, He Z, Zhang J, et al.Overexpression of endoplasmic reticulum molecular chaperone GRP94 and GRP78 in human lung cancer tissues and its significance[J]. Cancer Detect Prev,2005,29 (6):544-551.
　　[9]关明苏,兵吕元. 荧光定量RT-PCR检测人组织因子mRNA[J]. 复旦学报(医学科学版), 2002,29(1):66-69.
　　[10]陆�,徐莺莺,范恺谊,等.全反式维甲酸通过内质网应激诱导N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V受阻的人肝癌SMMC-7721细胞凋亡[J]. 复旦学报(医学版),2006,33(3):285-290.
　　[11]Ni M, Lee AS. ER chaperones in mammalian development and human diseases[J].FEBS Lett. 2007,581(19):3641-3651.
　　[12]聂芳菲,陈东明,赵霞,等. 内质网分子伴侣GRP94在瘢痕疙瘩中的表达[J]. 中国美容医学,2007,16(9):1184-1186.
　　[13]聂芳菲,陈东明,赵霞,等. GRP94在人增生性瘢痕组织中的表达及曲安奈德对其影响[J].中国美容整形外科杂志,2008,19(5):336- 339.
　　[14]Langer R,Feith M,Siewert JR,et al. Expression and clinical significance of glucose regulated proteins GRP78 (BiP) and GRP94 (GP96) in human adenocarcinomas of the esophagus[J]. BMC Cancer,2008,8:70.
　　
　　[收稿日期]2009-10-26[修回日期]2010-01-29
　　编辑/张惠娟