【骨髓间充质干细胞在糖尿病模型创面中向表皮细胞分化的初步研究】自体骨髓干细胞治疗糖尿病

　　[摘要]目的:探讨糖尿病皮肤创面微环境中的骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的可能性。方法:从大鼠骨髓中分离纯化骨髓间充质干细胞。选取第3～4代细胞,应用5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)标记技术进行细胞标记;同时采用一次性腹腔内注射链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型。2周后,在大鼠背部人工造成圆形创面,将已标记的骨髓间充质干细胞以注射方式回植入糖尿病大鼠创面组织周围,分别于注射后2、3周取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色。结果:BrdU阳性细胞出现在表皮、真皮及皮下组织各层,连续切片表皮层中部分阳性细胞同时也表达角蛋白。结论:在糖尿病溃疡愈合过程中,骨髓间充质干细胞具有向表皮细胞分化的潜能。
　　[关键词]骨髓间充质干细胞;糖尿病;创面愈合;表皮细胞;细胞分化
　　[中图分类号]Q813.11Q254[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)01-0065-03
　　
　　Preliminary study on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into epidermal cells in diabetic wound
　　ZHONG Xiao-hong,WANG Ming-gang,ZHAO Li-ping,GAO Xin-yu
　　(Department of Plastic Surgery,the Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230001,Anhui,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into epidermal cells under the microenvironment of diabetic wound.Methods MSCs were isolated from the myeloid tissue of the rats, purified and cultured. Third-or fourth-generation MSCs were selected and labelled with 5-bromodeoxyuridine (5-BrdU). The rats were injected intraperitoneally with streptozocin(STZ) once to establish diabetes rat model. After 2 weeks, a round skin was excised on all dorsal back of rats. BrdU-labelled MSCs were, by means of injection, engrafted to skin of the rats. The specimens were harvested from the wound tissues for paraffin embedding and serial section at the 2nd and 3rd week after transplantation and were immunohistochemically stained by either BrdU or keratin. Results BrdU positive cells aggregated in the epidermis, dermis and hypodermia. In serial section, some positive cells expressed keratin simultaneously in the epidermis. Conclusion During the course of the diabetic wound healing, MSCs have the potential for differentiating into epidermal cells.
　　Key words: marrow mesenchymal stem cells; diabetes mellitus; wound repair; epidermal cells; cell differentiation
　　
　　创面愈合是一个由细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并高度协调、相互调控的复杂的生物学过程,其中任何一个环节协调不良或功能障碍均可导致创面长期难以愈合;而慢性难愈合创面发生机制更加复杂,至今尚未完全阐明。在临床实践中,糖尿病溃疡的治疗是慢性创面愈合中最为棘手的问题。近年来,随着组织工程学研究的不断深入,干细胞受到前所未有的重视,特别是来源于骨髓的间充质干细胞;由于其具有向各种组织细胞分化的巨大潜能[1],且免疫原性小,所以骨髓间充质干细胞的应用为糖尿病溃疡的愈合提供可能。本实验以大鼠为研究对象,将骨髓间充质干细胞植入糖尿病大鼠创面组织周围,观察其向皮肤表皮细胞分化的潜能。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 实验动物:健康SD雄性大鼠8只,年龄4～6周,体质量为134～161g。购自安徽医科大学附属省立医院实验动物中心。1.2 主要试剂和仪器:胎牛血清(FCS)(Hyclone公司);L-DMEM培养基(Hyclone公司);胰蛋白酶(Sigma公司);5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)(Sigma公司);兔抗Brdu单克隆抗体及SP系列免疫组化染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);小鼠抗广谱细胞角蛋白单克隆抗体及即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);二氨基联苯胺(DAB)显色剂(北京中杉生物技术有限公司);BB16型CO2恒温、恒湿培养箱及HF-safe-1200型超净工作台(德国Heraeus and LISHEN公司);CKX41型倒置相差显微镜(日本Olympus公司);血糖仪和血糖试纸(欧姆龙公司)。
　　1.3 骨髓间充质干细胞的分离培养、纯化和扩增:将大鼠腹腔麻醉后引颈处死,75%酒精浸泡10min;无菌条件下取出股骨和胫骨,并用纱布将骨表面肌肉磨净,离体的骨放入培养皿中,用高压灭菌过的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,再移入另一培养皿中,加入3ml培养液;将骨的两端剪断,暴露骨髓腔,lml注射器抽取培养液注入股骨和胫骨,小心冲出骨髓,反复冲洗4～6次,直至腔内所有骨髓血冲净;将含骨髓细胞的培养液移入15ml离心管中,1 500r/min离心5min;弃上清,加入2ml含10%FCS的L-DMEM培养液,充分吹散细胞后按1×106/ml密度接种于细胞培养皿内,再加入8ml含10%FCS的L-DMEM培养液(含100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素),于37℃、5%CO2培养箱中培养,24h后更换培养液,弃去未贴壁的细胞,每隔2～3天换液,待长满80%左右按1:2比例传代,取培养较纯的第3～4代细胞备用。
　　1.4 骨髓间充质干细胞的5-BrdU标记:选用第3～4代细胞,细胞移植前48h,以含终浓度为10μmol/L的5-BrdU进行标记;2天后,0.25%胰酶室温下消化、1 500r/min离心5min,PBS洗涤、收集细胞。
　　1.5 动物模型的建立和骨髓间充质干细胞的输注:取SD雄性大鼠6只,适应性喂养2周后,禁食12h,按65mg/kg体质量剂量一次性腹腔内注射链脲佐菌素(溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液,pH4.4);48h后,连续三次裁尾取血,用欧姆龙血糖试纸测试大鼠的血糖值均≥16.7mmol/L,糖尿病大鼠模型诱导成功;同时用0.3%戊巴比妥钠按10ml/kg体质量剂量作大鼠腹腔注射麻醉[2];待麻醉成功后,在大鼠背部制作半径为0.8cm的圆形创面,取密度为1.0×106/ml 5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞1ml,均匀注射于大鼠创面边缘;分别于注射后2、3周切取创面中央再生组织块,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,2μm连续切片,备用。
　　1.6 免疫组织化学染色:连续切片采用SP法进行免疫组织化学染色,严格按照美国ZYMED公司提供的免疫组织化学试剂盒说明书操作,DAB显色剂显色。兔抗Brdu单克隆抗体工作浓度1:100;小鼠抗广谱细胞角蛋白单克隆抗体工作浓度1:50。以非特异血清代替一抗作为阴性对照,以细胞核呈深棕色着色为BrdU阳性细胞,角蛋白阳性细胞胞浆呈棕黄色。
　　
　　2结果
　　
　　2.1骨髓间充质干细胞纯化和扩增:细胞接种24h后,换液弃去未贴壁细胞,贴壁的骨髓间充质干细胞大多呈圆形或不规则形,散在生长,分布不均,含有较多杂质细胞。约5～6天后,骨髓间充质干细胞开始成集落样生长。随着细胞密度的增加,胞体变得细长,杂质细胞随着多次换液渐渐减少。约10～12天时,细胞已基本长满皿底,见图1A。原代培养12～14天时,杂质细胞随着换液全部清除,贴壁细胞形态比较一致;经胰酶消化后1∶2传代,传代后每2～3天换液1次,约7天长满皿底。连续传至第3～4代后,骨髓间充质干细胞形态上更加趋于一致,为成纤维细胞样细胞,呈漩涡状、辐射状或网状排列,生长旺盛,见图1B。
　　2.2HE染色:新生表皮较厚,细胞层数较多且分层明显,基底细胞呈单层柱状排列,结合紧密,组织结构完整,较多的皮肤附属器分布于真皮层中,见图2。
　　2.3免疫组织化学染色:第2、3周创面组织切片中,表皮、真皮及皮下组织中均可见到BrdU阳性细胞,细胞核呈深棕色;连续切片表皮层中部分BrdU阳性细胞同时也表达角蛋白,细胞胞浆呈棕黄色,见图3A、B。这就说明了部分细胞可能为植入带有5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞转化而来的表皮细胞。
　　
　　3讨论
　　
　　体表慢性难愈性创面的治疗一直是临床上倍受关注的问题,由于其发病机制复杂、病程长,已成为外科领域的一大难题,尤以糖尿病溃疡的治疗最为棘手。近年来,随着我国人民生活水平的不断提高和逐步进入老龄化社会,糖尿病的发病率呈现明显的升高趋势,糖尿病溃疡作为糖尿病的常见并发症,具有难治愈、易感染和高截肢率的特点;这不仅给患者带来极大的痛苦,也给社会增加了沉重的负担。因此,如何促进糖尿病溃疡愈合已经成为急需解决的问题。
　　骨髓间充质干细胞是骨髓中非造血干细胞的另一类重要干细胞,来源于中胚层,有很强的自我复制和多向分化的潜能,可以产生具有各种表型的子代细胞,分布于全身的结缔组织中[3]。由于骨髓间充质干细胞是未分化的前体干细胞,表型分化尚不成熟,免疫原性小,所以同种异体移植骨髓间充质干细胞后无排斥反应或反应较弱,能够作为组织工程中多种种子细胞。国外许多研究结果证实,骨髓间充质干细胞可以分化为多种不同类型的细胞,包括成纤维细胞、骨和软骨、肌肉(骨骼肌和平滑肌)和神经细胞等[4-11];有文献显示骨髓间充质干细胞对受损创面有明显促愈作用[12],这可能与骨髓间充质干细胞能够释放许多促进创面愈合的生长因子和细胞因子有关[13-17];Badiavas等[18]已成功证明在急性皮肤创面微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表皮细胞的潜能;这也为其在慢性创面中向表皮细胞分化提供一种设想依据。
　　细胞角蛋白是表皮或上皮组织较特异表达的一类蛋白,通常情况下,骨髓间充质干细胞角蛋白呈阴性表达。本实验应用5-BrdU标记的异体骨髓间充质干细胞输注入糖尿病大鼠创面组织周围,免疫组织化学染色检测表皮层中已标记的细胞是否表达角蛋白,从而推测骨髓间充质干细胞在糖尿病创面中是否具有向表皮细胞分化的潜能。糖尿病大鼠模型的制作是采用一次性向大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,注射48h后,连续三次检测大鼠血糖值均明显高于正常值,符合糖尿病模型的诊断标准。免疫组织化学染色结果显示新生表皮层中含有较多的BrdU染色阳性细胞,而且部分阳性细胞同时表达角蛋白;最终的实验结果提示:在糖尿病溃疡愈合过程中,骨髓间充质干细胞具有向表皮细胞分化的潜能。
　　目前,骨髓间充质干细胞分化为多种类型细胞的分子机制和分化能力尚未完全阐明,这可能是限制其应用研究的主要因素。国外研究结果证实了干细胞是存在于高度受调控的被称为“壁龛”的微环境中[19-20];但壁龛的组织成分相当复杂,各种不同的组织细胞所处的微环境不同,其中最主要的就是各种因子的不同;而且多数学者也一致认为,骨髓间充质干细胞分化为何种细胞也与其所处的微环境密切相关,这是骨髓间充质干细胞向其他组织细胞分化的主要原因之一。因此,处于受损皮肤的微环境下,骨髓间充质干细胞可能具有向皮肤组织细胞转化的潜能。本实验采用人工制作糖尿病溃疡微环境来诱导骨髓间充质干细胞在慢性创面中向表皮细胞转化,实验结果证实了该细胞具有分化为表皮细胞的能力,促进了糖尿病创面的愈合;但是,慢性创面微环境中的骨髓间充质干细胞转化为皮肤组织细胞的分化机制与分化能力是否和在急性创面微环境中有所不同,以及转化的表皮细胞是否具有正常的生理功能等这些问题尚没有相关文献报道;新生的真皮层中分布较多的皮肤附属器,是由骨髓间充质干细胞分化而来还是愈合中自身形成的,还需要进一步研究证实。
　　总之,在糖尿病溃疡愈合过程中,骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞已得到初步证实,可以作为治疗该病的一种种子细胞,为今后临床上治疗糖尿病创面提供一种有效的手段。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2009-11-02 [修回日期]2010-01-05
　　编辑/张惠娟