非小细胞肺癌能治好吗 胶原三肽对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响

　　[摘要]目的：研究胶原三肽对B16黑素瘤细胞的影响，探讨其美白作用与机制。方法：本文以B16黑素瘤细胞作为受试细胞，以浓度为10μg/ml曲酸作为阳性对照，研究胶原三肽对其增殖、细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响。结果：胶原三肽浓度范围为50～400μg/ml时对B16黑素瘤细胞增殖无明显影响，但均能显著抑制黑色素合成。且400μg/ml胶原三肽抑制酪氨酸酶活性具有极显著性。结论：胶原三肽具有一定的美白功能。
　　[关键词]胶原三肽；B16黑素瘤细胞；黑色素合成；酪氨酸酶活性；细胞增殖
　　[中图分类号]739.5[文献标识码] [文章编号]1008-6455（2011）06-0939-03
　　
　　Effect of collagen tripeptide on melanogenesis in B16 melanoma cells
　　CHENG Jing1, CHEN Dong-liang1,JIANG Xue-qiong2,CHEN Da-wei2,YANG Guo-yan1,TANG Liang-yan2,
　　WANG A-jing1
　　(1.Wuhan Peptide Substance Research Institute,Wuhan 430023,Hubei,China;2.Wuhan Hopsun Biological Product Inspection Co.,LTD)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo study the effects of collagen tripeptide on B16 melanoma cells.MethodsThe cell proliferation, the tyrosinase activity and the melanin content were detected, using kojic acid as stnadard control.ResultsThe results showed there were no perceptible effect on B16 cell proliferation, but melanin was decreased significantly by the concentrations of collagen tripeptide from 50μg/ml to 400μg/ml. The tyrosinase activity was inhibited remarkably by 400μg/ml collagen tripeptide.ConclusionCollagen tripeptide could inhibit melanogenesis in B16 melanocytes obviously.
　　Key words: collagen tripeptide(CTP);B16 melanoma cells;melanogenesis;tyrosinase activity;cell proliferation
　　
　　人类皮肤的颜色主要取决于黑色素的含量与分布，而黑色素细胞的结构功能和数量直接影响皮肤中黑色素的含量。传统的美白化妆品采用过氧化氢，氯化氨基汞以及各种酚类衍生物等能使黑色素组织迅速分解，但其对皮肤具有腐蚀性，细胞毒性和过敏性，目前许多国家已禁用此类物质[1]。因此，寻找新的安全的美白产品是极为迫切的。
　　研究表明[2]，胶原肽具有安全性高、细胞粘结性好、透明、无臭和无刺激等特点，可作为化妆品原料。陈龙等[3]发现鱼胶原肽具有抑制酪氨酸酶活性功能，且抑制能力远高于市场上的同类产品。王静凤等[4]发现鱿鱼皮胶原蛋白多肽具有降低黑色素含量、抑制酪氨酸酶活性以及下调酪氨酸酶mRNA表达的功能。王奕等[5]发现日本刺参胶原肽具有促进B16细胞增殖，抑制黑色素合成和酪氨酸酶活性，下调酪氨酸酶mRNA表达的功能。
　　胶原三肽（collagen tripeptide CTP）是组成胶原的最小单位，其结构可表示为�Gly-x-y�是一种N端带有甘氨酸的高纯度三肽。胶原三肽平均分子量约为280Da。研究发现，胶原三肽具有优异的保湿效果和渗透性，同时还能够促进胶原和透明质酸的合成[6]。
　　本研究以胶原三肽为研究对象，探讨其对B16黑素瘤细胞黑素合成，酪氨酸酶活性以及细胞增殖的影响。
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　1.1.1小鼠B16黑素瘤细胞株：购于武汉博士德生物工程有限公司，于RPMI1640培养液（含10%小牛血清，105U/L青霉素，105U/L链霉素）、37℃、5%CO2培养箱中培养，每3天传代一次。
　　1.1.2胶原三肽：由武汉天天好生物制品有限公司提供。
　　1.1.3主要药品和仪器：RPMI1640培养液、胰酶、无菌PBS（武汉博士德生物工程有限公司），L-DOPA（sigma），MTT（sigma），脱氧胆酸钠（分析纯），DMSO（分析纯），6孔板（武汉博士德生物工程有限公司），96孔板（武汉博士德生物工程有限公司），细胞培养瓶（武汉博士德生物工程有限公司），10ml具塞试管（武汉博士德生物工程有限公司），酶标仪（南京江南光学仪器厂），SW-CJ.2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），XSP-15CZ倒置显微镜（上海长方光学仪器有限公司），CO2培养箱（Heraeus）。
　　1.2方法
　　1.2.1细胞增殖活性测定：取对数生长期的B16细胞，经0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液200μl，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁24h后，弃培养液，曲酸对照处理组加入含有曲酸（浓度为10μg/ml）的完全培养液200μl，胶原三肽组加入含有胶原三肽（浓度分别为50μg/ml，200μg/ml，400μg/ml）的完全培养液200μl，空白组加入等量的完全培养基。每个浓度设6个复孔，连续培养72h。MTT法于酶标仪570nm处测定吸光度（A）值，以A值表示细胞增殖活性。
　　1.2.2酪氨酸酶活性测定：酪氨酸酶活性是根据多巴向多巴醌氧化的速度来确定。调整细胞浓度至5×105/ml，接种于6孔板，每孔2ml。胶原三肽组、曲酸对照处理组及空白组处理同1.2.1。每个处理重复6个孔。本研究参照Hideya Ando等[7]的方法，加入0.5%脱氧胆酸钠溶液并充分震荡使细胞破碎，以L-DOPA为反应底物，475nm进行检测。酪氨酸酶活性计算公式为：
　　酪氨酸酶活性=(A1－A2)/细胞数
　　注：0min的吸光度为A1,10min的吸光度为A2
　　1.2.3黑色素含量测定：调整细胞浓度至5×105/ml接种于6孔板，每孔2ml。胶原三肽组、曲酸对照处理组及空白组处理同1.2.1。每个处理重复6个孔。本研究参照Hideya Ando等[7]的方法，加入含有10%DMSO的1mol/L NaOH，超声破碎30min，置于80℃水浴30min，470nm处测定吸光度（A）。黑色素含量计算公式为：
　　黑色素含量=A/细胞数
　　1.3 统计学处理：实验数据采用SPSS11.0软件进行统计处理。
　　
　　2结果与分析
　　2.1 细胞增殖活性测定：空白组，曲酸对照处理组及胶原三肽各处理组吸光度检测值经统计分析处理后无差异显著性（P＞0.05）（如图1所示），即空白组，曲酸对照组及胶原三肽各处理组细胞活性及细胞增殖程度无明显差异。表明胶原三肽浓度范围为50～400μg/ml时对B16黑素瘤细胞增殖无明显影响。
　　2.2 酪氨酸酶活性测定：胶原三肽浓度为400μg/ml时，其酪氨酸酶活性与空白组酪氨酸酶活性差异具有极显著性（P＜0.01）（如图2所示）。曲酸对照处理组的酪氨酸酶活性与空白组酪氨酸酶活性差异具有极显著性（P＜0.01）。但400μg/ml胶原三肽抑制酪氨酸酶活性与曲酸对照处理组抑制酪氨酸酶活性能力无显著性差异（P＞0.05）。
　　2.3 黑色素含量测定：胶原三肽浓度为50～400μg/ml时均能显著降低B16黑素瘤细胞中黑色素的含量，且浓度为50μg/ml时其黑色素含量与空白组黑色素含量具有差异极显著性（P＜0.01）（如图3所示）。曲酸对照处理组的黑色素含量与空白组黑色素含量亦呈现差异极显著性（P＜0.01）。50μg/ml胶原三肽组黑色素含量低于曲酸对照组黑色素含量且差异具有显著性（P＜0.05），即50μg/ml胶原三肽抑制黑色素合成的能力强于曲酸对照处理组。
　　3讨论
　　正常情况下，决定皮肤颜色的主要原因有皮肤内各种色素的含量和皮肤的厚度及光线在皮肤表面的散射现象，其中黑色素起主要作用[8]。而酪氨酸酶是黑素生成途径中的主要限速酶。本研究结果表明400μg/ml胶原三肽处理组的酪氨酸酶活性与空白组相比具有差异极显著性，其与曲酸对照处理组抑制酪氨酸酶活性能力相当。且抑制能力与胶原三肽浓度呈正比，这与陈龙等[2]的研究结果相似。浓度范围为50～400μg/ml时胶原三肽均能显著抑制B16黑素瘤细胞内黑色素合成，且浓度为50μg/ml时其抑制能力最强，远高于曲酸对照处理组。但浓度为50μg/ml的胶原三肽抑制酪氨酸酶活性的能力并不显著，提示胶原三肽抑制黑色素合成可能与合成途径中的多个酶有关，也可能通过其他途径干预黑色素合成。浓度为50～400μg/ml胶原三肽其对B16黑素瘤细胞的增殖活性无明显影响。
　　本实验结果显示胶原三肽对B16黑素瘤细胞增殖活性无明显影响，但具有抑制B16黑素瘤细胞内酪氨酸酶活性功能及抑制细胞内黑色素合成的功能，表明胶原三肽具有一定的美白功能。其具体机制仍需进一步探索。
　　
　　[参考文献]
　　[1]王白强,曾晓军.酪氨酸酶活性的抑制研究及皮肤美白化妆品的研制[J].福建轻纺,2002,7:1-6.
　　[2]丁卓平,刘振华,李仁冬,等.罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取条件的研究[J].水产科技情报,2006,33（4）：190-192.
　　[3]陈龙,陈栋梁,杨国燕,等.鱼胶原肽抑制酪氨酸酶酶活性能力的比较研究[J].中国美容医学,2008,10：1512-1514.
　　[4]王静凤,王奕,崔凤霞,等.鱿鱼皮胶原蛋白多肽对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响[J].营养学报,2007，23(9):1181-1184.
　　[5]王奕,王静凤,张瑾,等.日本刺参胶原肽对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响[J].营养学报,2007,29（4）：401-404.
　　[6]摘译自：胶原水解物的皮肤渗透性及生物功能性[J].日本写真学会志.2004,67（4）：397-401；缪进康.译.明胶科学与技术,2006,26（1）：33-39.
　　[7]Hideya Ando,Akira Itoh,Yutaka Mishima,et al. Correlation between the number of melanosome,tyrosinase mRNAlevels,and tyrosinase activity in cultured murine melanoma cells in response to various melanogenesis regulatory agents[J].J Cell Physiol,1995,163：608-614.
　　[8]张学军.现代皮肤病理学基础[M].北京:人民卫生出版社,2001:87-88.
　　
　　[收稿日期]2011-03-10[修回日期]2011-05-23
　　编辑/张惠娟
　　 注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”