牙周膜干细胞_人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究

　　[摘要]目的：分离筛选人牙周膜干细胞，研究其生物学特性并进行初步鉴定。方法：采用STRO-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，观察细胞生长及克隆形成情况，流式细胞仪细胞周期、细胞表型分析，免疫细胞化学染色技术检测STRO-1、Vimentin表达，并测定细胞体外多向分化能力。结果：免疫磁珠法可获得人牙周膜干细胞，细胞具有克隆形成能力，增殖速度低。细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;细胞表型分析证实CD146、CD44高表达，CD34、CD45低表达。STRO-1及Vimentin均为阳性染色，矿化诱导和成脂诱导证实该细胞具有多向分化能力。结论：免疫磁珠法是有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法。所分离细胞具有干细胞的细胞周期、表型特点及多向分化能力。
　　[关键词]干细胞；人牙周膜干细胞；免疫磁珠；流式细胞计量术；免疫细胞化学
　　[中图分类号]R783.5 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）05-04
　　
　　Isolation, identification and bionomics of human periodontal ligament stem cells
　　PAN Feng1,DING Yin1,WANG Guang1,ZHAO Yu2,NI Hua2
　　(1.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China; 2.Center of Tissue Engineering, Stomatology Hospital,The Fourth Military Medical University)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.
　　Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry
　　
　　研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。因此，牙周膜干细胞（PDLSCs）作为一种新发现的干细胞，在牙周组织工程研究中有较大的应用前景。但是牙周膜组织量小、分离困难，一直成为制约牙周膜干细胞研究的重要原因。已有的克隆筛选法操作程序繁琐，周期较长[1]，因此需要寻找简便、快捷的筛选方法来分离牙周膜干细胞。本研究应用免疫磁珠技术对人牙周膜干细胞进行筛选，并扩增培养，通过对牙周膜干细胞生长曲线、克隆形成率、细胞周期、细胞表面抗原标记物测定及多向分化能力的研究对其生物学特性进行研究，以期建立一种便捷有效的分离方法并明确牙周膜干细胞的生物学特性，为进一步研究牙周损伤的发病机理及临床治疗提供基础。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1实验材料和设备：α-MEM培养基（Gibco，美国），羊抗小鼠磁珠试剂盒（Dynalbiotech，美国)，基质蛋白-l单克隆抗体(STRO-1，R&D，美国)， ABC型免疫组化检测试剂盒(Dkao，美国)；小鼠抗人波形丝蛋白单抗(Vimentin，Dkao，美国)；CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人单克隆抗体（Beckmen Coulter，美国）；CO2孵箱(Heraeus，德国)；YJ-875型超静工作台(苏州净化设备厂，中国)；流式细胞分析仪(Beckmen Coulter，美国)；倒置相差显微镜及照相系统(Olympus，日本)。
　　1.2实验方法
　　1.2.1 取材及细胞培养：收集临床拔除的正常人牙周健康、无龋的新鲜第3磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，移入10cm无菌培养皿内，滴加少许α-MEM培养液保持组织湿润，锐性分离牙周膜组织约1mm3组织块，将分离的组织块以1mm间距平铺于6孔板内，以无菌盖玻片覆盖组织块，加入培养液(含100ml/L 胎牛血清，100μmol/L2抗坏血酸，2mmol/L2谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的α-MEM 培养液)，置入37℃、50ml/L CO2的孵箱中培养，待多数组织块周围有细胞游出后去除盖玻片，常规培养，每3天换液1次，细胞生长达80%汇合时传代。
　　1.2.2磁珠分离筛选牙周膜干细胞：将5μl磁珠剧烈振荡后移入离心管内，加入5ml含1％胎牛血清的PBS冲洗，放置于磁力架上静置2min后去上清，重复一次后重悬，置4℃备用。收集第4代人牙周膜细胞1×108个，以含1％胎牛血清的PBS重悬，加入小鼠抗人STRO-1抗体，4℃孵育60min，每隔10min轻振以防沉淀。以含1％胎牛血清的PBS清洗3次，去除残留抗体后重悬并加入磁珠，4℃孵育30min，每5min轻振一次。离心，去除含空白磁珠的上清液，以含1％胎牛血清的PBS重悬，将离心管置于磁力架上2min，缓慢弃除上清及未与磁珠结合的细胞。以含1％胎牛血清的PBS再次重悬并清洗与磁珠结合的细胞2次，弃上清，加入磁珠分离液，轻晃均匀2min后置于磁力架上2min，取上清液，重复2次以去除残存磁珠，离心，加入5ml含10％胎牛血清的α-MEM培养液，重悬，调整细胞浓度为1×104/ml接种于6孔板内，37℃、50ml/L CO2的孵箱中培养。
　　1.3 牙周膜干细胞生物学特性的研究
　　1.3.1细胞生长曲线测定：分别取筛选培养的牙周膜干细胞及牙周膜细胞，以1×103cells/孔接种于96孔塑料板，每组3孔，隔日换液。每天取一组，MTT法测各孔OD值，连续测10天，以时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线。
　　1.3.2 克隆形成率测定：将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清1 500rpm离心10min，经0.22μm直径的小滤器过滤后，与培养基以l:l比例混合作为适应性培养基。取筛选培养的牙周膜干细胞，调整细胞密度至10～15个/ml，100μ1/孔接种于96孔培养板中，培养12h后标记单个细胞孔，并补液至200μ1/孔，5天换液，光镜下观察克隆形成情况。
　　1.3.3 流式细胞仪分析
　　1.3.3.1细胞周期分析：取筛选培养的牙周膜干细胞，胰酶消化，调整细胞密度为1×107/ml， PBS清洗2次，加入0.01mol/LPBS重悬，再加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀，4℃过夜，离心弃乙醇，0.01mol/LPBS清洗2次，加入5ml/L碘化丙锭1ml，4℃30min，过300目的尼龙筛网，流式细胞仪上机，进行细胞周期检测。
　　1.3.3.2表面抗原测定：取筛选培养的牙周膜干细胞, 弃去培养液，PBS清洗两次，以含0.25% 胰蛋白酶的PBS液消化5 min，制成单细胞悬液，再以含2%牛血清白蛋白和0.1%偶氮钠的磷酸盐缓冲液(流式缓冲液)冲洗细胞, 调整细胞密度为3.0×109/L，每个Eppendof管加100μL细胞悬液，室温下分别与CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人单克隆抗体5μL避光孵育15min，再以流式缓冲液清洗细胞，1 000rpm离心5min，将细胞重悬于含1%多聚甲醛的流式缓冲液0.5ml固定。使用同型对照单克隆抗体确定背景标记。用流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用%表示。
　　1.3.3.3 免疫细胞化学染色：取筛选培养的PDLSCs制备细胞爬片， 免疫细胞化学ABC法进行STRO-1及Vimentin染色，阴性对照以PBS替代一抗，进行细胞来源及表达检测，光镜下观察。
　　1.3.3.4体外多向诱导分化：①矿化诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为2×104/ml接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培养24h后换矿化诱导液(100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C、1×10-8mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、α-MEM培养液)培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液, PBS清洗, 95%酒精固定10min ,PBS清洗2次,加入0.1%茜素红(Alizarin Red-S)室温染色30min，去离子水清洗3次，光镜下观察。②成脂诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105/ml接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培养24h后换成脂诱导液（地塞米松10-6mol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mmol/L、胰岛素10mg/L、消炎痛100mmol/L、α-MEM培养液）培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液，PBS清洗，10％中性甲醛固定10min，PBS清洗2次，油红O染色10min，去离子水清洗3次，镜下观察。
　　
　　2结果
　　
　　2.1形态学观察：所筛选细胞大部分呈类梭形，核为卵圆形、位于胞质中央，似成纤维样细胞（如图1）。
　　
　　2.2 细胞生长曲线测定：牙周膜细胞及牙周膜干细胞生长曲线均呈倒“S”形，在接种后1天两者细胞量均减少，自第2天起，细胞生长均加速，第8天达到生长高峰，进入“平台期”，此后，细胞生长速度减慢。总体而言，干细胞生长速度明显低于牙周膜细胞（如图2）。
　　
　　2.3 牙周膜干细胞生物学特性研究
　　2.3.1 克隆形成率：10～12天有细胞克隆形成，镜下观细胞呈集落状生长，细胞形态成梭形，体积较小，排列紧密，中心细胞界限不清，呈圆形或不规则形状，周边细胞呈梭形或多角形。共获得克隆株43株，克隆形成率为14.93％。
　　2.3.2细胞周期分析：细胞周期动力学结果显示：大多数细胞处于G0/G1期(78.2％)，即静止期和DNA合成前期。G2期为2.3％，S期为19.5％。表明细胞增殖缓慢，大多数处于静止期或缓慢增殖期(如图3)。
　　
　　2.3.3 细胞表型特征鉴定：表面抗原CD146和CD44检测阳性率为92.8％及91.7％，CD34和CD45阳性率为1.6％及2.3％ （如图4）。
　　2.3.4 免疫细胞化学染色：筛选培养的牙周膜干细胞中STRO-1及Vimentin均为阳性染色，具有间充质干细胞的特征（如图5～6）。
　　2.3.5 成骨诱导：成骨诱导液继续培养8天后，细胞呈复层生长，局部增厚，12天左右中央出现许多颗粒样改变，并逐渐连接成片，密度增高。21天左右孔板底部出现肉眼可见针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大。茜素红染色可见红色矿化结节（如图7）。
　　2.3.6 成脂诱导：经成脂诱导液培养至第10天左右，可见细胞形态发生改变，较培养初期更为饱满，至21天时油红O染色阳性，细胞胞浆内有大量脂滴形成（如图8）。
　　
　　
　　3讨论
　　
　　以往成体干细胞的分离纯化常用方法有密度梯度离心法、贴壁培养法、克隆化培养筛选，但这些方法操作繁琐，且所需时间较长，不利于临床应用。根据干细胞表面特异性受体能选择性结合或粘附其它信号分子的原理，采用免疫磁珠筛选、流式细胞分选法分离和鉴定干细胞己广泛开展[3,9]。Seo[1]的研究结果显示人牙周膜干细胞表达间充质干细胞的特异性标志STRO-1，并利用免疫磁珠筛选首次成功获得人牙周膜干细胞。Gay等[4]使用STRO-1抗体对牙周膜细胞进行标记后，通过流式细胞仪对其进行筛选，获得27％STRO-1阳性细胞。在本实验中，我们通过使用包被二抗的免疫磁珠对复合STRO-1的牙周膜细胞进行分离纯化，获得牙周膜干细胞，筛选程序简单、迅速，细胞活性保持较好。经细胞生长曲线测定，牙周膜干细胞较同一来源的牙周膜细胞生长慢，符合干细胞慢增殖周期的特点。
　　克隆形成能力是干细胞的特点，高秦等[10]对人牙周膜细胞进行了克隆化培养，结果显示细胞培养10～15天有克隆形成，克隆形成率为0.62％。Gay等[4]对牙周膜干细胞及骨髓基质干细胞的克隆形成情况进行了比较，发现牙周膜干细胞有50个克隆形成，骨髓基质干细胞有35个克隆形成，证实牙周膜干细胞有较强的克隆形成能力。成体干细胞处于由周围间质细胞及其所分泌的相关生长因子或配体形成的微环境中，这些生长因子或配体与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。故为提高克隆形成率并尽可能的保持纯化后的细胞的未分化状态，本研究借鉴了高秦等[10]人牙周膜干细胞克隆化培养的方法，收集了牙周膜细胞的培养上清与普通培养基以一定比例混合，制备成适应性培养基，对所筛选的牙周膜干细胞进行了克隆化培养，共得到43个克隆，克隆形成率为14.93％，证实所获得细胞具有干细胞自我更新的特性。
　　细胞周期是反映细胞增殖动力学的重要指标。干细胞是处于相对静止状态的一群细胞，这种慢周期的特点是大多数成体干细胞的共同特征[11-12]。但在外界因素作用下，干细胞周期也会相应变化[13-14]。本研究对所筛选牙周膜干细胞的细胞周期分析显示，与高秦等[10]的结果有一定差异，可能原因有：①细胞来源不同，因不同个体的干细胞状态不会完全一致；②细胞获取方法不同，高秦等通过克隆化培养获取牙周膜干细胞，而本研究采用的是免疫磁珠直接筛选，不同的方法导致细胞所受外界条件刺激的不同，进而可能影响到细胞周期的变化。
　　目前，学者们还未找到牙周膜干细胞的特异性表面抗原标记物。Seo等[1]的研究结果显示牙周膜干细胞表达间充质干细胞表面抗原STRO-1及血管周围细胞表面标记物CD146及CD44。Nagatomo等[15]发现牙周膜干细胞表达细胞表面抗原CD105、CD166及STRO-1。Ivanovski等[16]发现牙周膜干细胞或骨髓基质干细胞均无CD14、CD45和CD34表达。高秦等[10,21]研究结果显示人牙周膜干细胞波形蛋白（Vimentin）及STRO-1呈阳性表达。在实验中我们对分离培养的细胞进行了表面抗原测定及免疫细胞化学染色，结果显示：Vimentin及STRO-l染色阳性，显示其间充质干细胞来源，此外，流式细胞分析结果显示间充质干细胞标记物CD44及CD146在牙周膜干细胞中高表达，而内皮细胞标记物CD34，造血系细胞标记物CD45的表达极低，从正反两方面证实了以往学者的结论。而多向分化研究结果也证实牙周膜干细胞可以经诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞，符合干细胞特征。
　　综上所述，本实验所筛选培养的人牙周膜干细胞为多角形、成纤维型细胞外观，具备克隆形成能力及慢细胞周期特点，免疫细胞化学染色及流式细胞术检测证实所培养细胞表达CD44、CD146、Vimentin、STRO-1，不表达CD34、CD45，均与文献报道一致。此外，经诱导培养，所培养细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞，进一步证实牙周膜干细胞具有多向分化能力。
　　
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　　[收稿日期]2008-04-21[修回日期]2008-05-05
　　编辑/何志斌