甲型H1N1流感住院发热病人咽拭子病毒核酸测定排查诊断:流感咽拭子

　　[摘要]目的探讨甲型H1N1流感诊断方法，以做好防控和临床救治。方法 对2009年8月至2010年2月马鞍山市传染病医院收治的111例甲型H1N1流感流行期间患者咽拭子RT-PCR病毒核酸测定诊断情况进行回顾性分析并总结。结果111例发热病人，RT-PCR病毒核酸测定确诊病例83例（阳性74.78%），临床诊断及疑似病例28例（阴性25.22%）。
　　[关键词]甲型H1N1流感； 发热病人； RT-PCR病毒核酸； 检测
　　[中图分类号] R511.6[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515（2010）-11-287-02
　　
　　本文对马鞍山市传染病医院收治住院的111例甲型H1N1流感流行期间所有发热病人咽拭子RT-PCR病毒核酸测定并对阳性患者治疗后再次复查，共采集上呼吸道标本124份，进行回顾性分析报告如下。
　　呼吸科共收治甲型H1N1流感流行期间住院的111例发热病人，RT-PCR病毒核酸测定确诊病例83例（阳性率74.78%），临床诊断及疑似病例28例（阴性率25.22%）。阳性病人治疗时间5～9天，平均6～7天后再次复查，咽拭子甲型H1N1病毒核酸检测均阴性，所有病例体温正常，流感样症状消失，临床症状稳定。初步判断甲型H1N1流感治疗后RT-PCR病毒核酸最长转阴时间5～9天。测定结果与临床症状基本相符。
　　1 临床标本的采集
　　（由马鞍山市传染病医院呼吸科临床医师完成）
　　1.1采集对象所有收治住院甲型流感（ H1N1）流行期间发热病人、疑似病人、确诊病例治疗后病人，均采集上呼吸道标本来检测进行RT-PCR甲型H1N1病毒的相关检测。共采集上呼吸道标本124份（包括复查）送检（由马鞍山市传染病医院呼吸科临床医师完成）。
　　1.2采集种类鼻咽拭子或者鼻腔冲洗液。口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰、气管插管的病人也可收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒运输液（ VTM ）中，密封，置于特制箱，周围用冰块或冰排保存，立即运送至马鞍山市疾病控制中心实验室进行检测。
　　1.3采样器材要求
　　1.3.1拭子应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做杆，不推荐棉拭子和木杆，不能用海藻酸钙做的拭子收集标本。标本采集管应包含3毫升病毒运输液。
　　1.3.2采样管外螺旋口、耐－70℃冻存的标准管
　　1.3.3采样液含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液（可使用Hank"s或Eagle"s等培养液加入抗菌素和0.5%BSA）
　　1.3.4临床标本储存所有呼吸道标本应保存在-70℃度冰箱中，如果没有，应保存在4℃冰箱，但不应超过4天。
　　1.3.5临床标本运输应按照A类包装标准进行样品的包装，所有标本应标示清楚。病例标本运送应包含病例的详细信息。
　　1.3.6标本运送方式省内运送：公路运输，专人（由马鞍山市传染病医院呼吸科临床医师完成），专车（由马鞍山市传染病医院120完成）。
　　2临床标本检测
　　（由马鞍山市疾病控制中心实验室完成）
　　2.1流感快诊检测以区别甲、乙型流感病毒，如乙型流感阳性可排除甲型H1N1流感，全部阴性结果则不能排除甲型H1N1流感。
　　2.2RT-PCR检测针对甲型流感病毒的特异性引物，有效地诊断病毒感染；甲型流感病毒（H1N1）PCR引物
　　SW Inf A:目标片段大小164 bp
　　5`-GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG-3`
　　5`-GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC-3`
　　SW H1:目标片段大小115 bp
　　 5`-GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA-3`
　　 5`-CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC-3`
　　检测实验室生物安全防护要求； 采集疑似感染甲型H1N1病毒病毒的患者临床标本、进行标本处理、包装、诊断性检测的工作人员必须进行严格的安全防护。
　　所有的涉及病例标本的实验操作（包括样本的处理、包装及包装拆除）必须在生物安全柜内进行，呼吸防护装备，检测合格的N95呼吸器或更高级别的防护装备，鞋套，前封式手术服，双层手套，眼部防护装备（护目镜或面罩）。
　　3结果
　　疑似病例或临床诊断病例（28例）：RT-PCR病毒核酸测阴性，符合下列情况之一：⑴.密切接触者发病前7天内接触传染期甲型H1N1流感病例，并出现流感样临床表现的。密切接触者是指在未采取有效防护情况下接触传染期甲型H1N1流感病例的人群，具体包括：诊断、治疗或护理、探视甲型H1N1流感病例的人员；与病人共同生活、工作的人员；接触过病人的呼吸道分泌物、体液的人员。⑵.发病前7天内曾到过甲型H1N1流感流行（出现病毒的持续人间传播和基于社区水平的流行和暴发）的国家或地区，也包括曾到过明确有甲型H1N1流感流行的社区，出现流感样临床表现。⑶.出现流感样临床表现，甲型流感病毒（非H1N1）检测阳性，但进一步检测排除既往已存在的亚型 。确诊病例：（83例）甲型H1N1流感病毒核酸RT-PCR方法检测阳性，出现流感样临床表现。
　　4 讨论
　　甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，典型病毒蛋颗粒呈球状，直径为80～120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是红细胞血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质白M2。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称,直径为10nm。为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。病毒对乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒剂敏感；对热敏感，56℃条件下30分钟可灭活流感病毒，有甲、乙、丙三种，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型（H1-H16），神经氨酸酶9个亚型（N1-N9），目前，已从猪身上分离到四种主要的亚型：H1N1、H1N2、H3N2和H3N1。 甲型流感病毒H1N1亚型是目前疫情的主要病原体甲型H1N1流感是由A/H1N1流感病毒引起的新发急性呼吸道传染病，具有年轻人群患病率及死亡率高、传染性高于季节性流感等特点，一旦发病，蔓延十分迅速。2009年6月11日世界卫生组织（WHO）宣布将甲型H1N1流感大流行警告级别提高为最高级6级、卫生部已明确甲型H1N1流感为乙类传染病，病采取甲类传染病的预防控制措施，为尽快发现、诊断和救治可能发生的甲型H1N1流感病例，目前对甲流最快速有效的诊断方法是依赖于PCR原理的病毒核酸监测，我国主要应用的是RT-PCR技术，我市主要应用的也是RT-PCR技术。
　　但是值得注意的是：临床PCR影响因素很多，很容易出现错误的结果。发挥PCR更大的作用，笔者认为必须做到以下几点：
　　4.1加强标本管理疑似流感病人呼吸道标本规范采集，运送，核酸检测是值得注意关键环节，至关重要。当疑似甲流病人呼吸道标本（鼻拭子、咽拭子，鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液或气管吸取物）运送到PCR实验室后，实验室人员必须按照规定程序收集标本，首先核对“疑似感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单”，仔细确认标本采集时间、保存方式及运送方式符合要求后才能接受标本。当发现采集和运送不规范的标本时，应立即电话通知临床医护人员重新规范留取；同时对于不能及时检测的标本要严格按规定保存和管理。
　　4.2做好室内质控实验室工作人员在充分了解PCR测定的不确定性基础上，采取相应质控措施，才能确保实验结果的准确性。目前部分PCR实验室还存在一些室内质控不规范的问题，比如说忽视了空白管和阴性对照管的重要性，省去了高低值；室内质控原始数据未保存，不绘图，对失控或系统误差无分析和处理意见；在更换试剂或耗材时不做相关质量控制和比对试验等等。
　　4.3重视仪器维护与管理PCR试验对仪器的依赖性是很高的，许多仪器如离心机、扩增仪都可能是造成PCR假阴性的因素，工作中一定要重视主要仪器设备的日常维护。
　　4.4PCR实验室具备较好的生物安全防护设施和设备，污物标本处理规范，日常消毒灭菌及时登记，检验人员加强自我防护意识，不造成各区域混杂，不逆向行走，不导致假阳性和假阴性试验结果的出现，减少检验人员潜在感染的职业风险。
　　参考文献
　　[1] 中华人民共和国卫生部. 甲型H1N1流感诊疗方案(2009年试行版).传染病信息，2009，22（3）：1-3.
　　[2] 张伟民，王伯昌，夏晓华.82所临床基地扩增实验室复审结果和现状分析.浙江检验医学，2006，3：19-20.
　　[3] 李金明.聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性.中华检验医学杂志，2005，28（3）：225-227.