【海洋真菌Trichothecium,sp.中的甾体化合物】 甾体化合物

　　[摘要]从南海采集的红树林根上分离得到的海洋真菌Trichothecium sp.中分离得到2个甾体化合物，根据理化性质和1H-NMR、13C-NMR等波谱数据分析鉴定它们的结构分别为：麦角甾-8 (9)，22 E -二烯-3β，5α，6β，7α-四醇(1)、5α，8α-过氧麦角甾-6，22 E -二烯-3β-醇(2)。
　　[关键词]海洋真菌； Trichothecium sp.； 甾体
　　[中图分类号] O657.31[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515（2010）-12-005-01
　　
　　Steroids from marine fungus Trichothecium sp.
　　Yao Yao1,2*Li Juan1Wang yan1Yan Qian-Shun1Cao Jia-Qing3
　　(1 College of Basic Medical Science, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, P.R.China;
　　2 Research Center of Medical Science and Technology, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, P.R.China;
　　3 School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, P.R.China)
　　[Abstract] Two steroids have been isolated from marine fungus Trichothecium sp. collected from South China Sea. They were identified as ergosta-8(9)，22E-diene-3β，5α，6β，7α-tetraol(1) and 5α，8α-epidioxyergosta-6，22E-dien-3β-ol(2) on the basis of spectral data.
　　[Keywords] Marine Fungus; Trichothecium sp; Steroids
　　
　　1 前言
　　微生物药物是天然药物极为重要的组成部分。在过去的70多年里，人们从陆生微生物筛选到的具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心血管疾病及免疫调节剂等生理活性的微生物代谢产物已超过万种，大量生产和广泛应用的己达百种以上[1-2]。但是，经过几十年长时间的开发，从陆栖微生物找到新活性物质的几率越来越小，筛选的难度越来越大。因此，科研工作者把目光投向了海洋，由于海洋与陆地的环境不同，使海洋微生物产生了陆生微生物所不具有的代谢机制，从而产生了很多结构新颖的代谢产物。又因为海洋微生物具有微生物本身的特点，容易驯化，生长周期短，易于通过育种提高目的物的产量，所以可用发酵的方式进行大规模培养，工业化生产海洋生物活性代谢产物。因此，研究海洋微生物对新药的开发、生态环境保护和经济可持续发展都具有重要意义。本文报道海洋真菌Trichothecium sp.中2个甾体化合物的分离及结构鉴定，它们分别是麦角甾-8(9)，22 E -二烯-3β，5α，6β，7α-四醇(1)、5α，8α-过氧麦角甾-6，22 E -二烯-3β-醇(2)。
　　2 实验部分
　　2.1 仪器
　　MP-S3型显微熔点测定仪（温度未校正，日本Yanaco公司）；QP5050SA型气相质谱连用仪(日本Shimadzu公司)；Bruker-AV600核磁共振仪(TMS内标，瑞士Bruker公司)；LC-8A高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)。柱色谱用硅胶及薄层色谱用硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH20填料（瑞士Pharmacia公司）；色谱纯甲醇（天津康科德科技有限公司）；其他试剂均为分析纯（天津江天化工科技有限公司）。
　　2.2 菌株的鉴定及发酵产物的提取分离
　　菌株由2000年3月南海采集的红树林根上分离得到，经培养条件测试，在马铃薯玉米浸汁培养基上产生的抑真菌活性最高，培养配方如下：马铃薯浸汁100ml，玉米浸汁10 ml，葡萄糖7g，陈海水600mL，水300 mL。25℃，150rpm振荡培养12天，发酵量30L。
　　菌落浅粉色，分生孢子梗直立，不屈曲，不分隔或有少数隔膜，不分枝，顶生孢子多个，分生孢子长圆形，双细胞，分隔处略缢缩，无色或浅色。根据此特征鉴定为单端孢属Trichothecium sp.。
　　大量发酵生产菌Trichothecium sp.37-04菌株，得到发酵液30L，16层纱布过滤，分别得到菌丝体和水层。菌丝体（湿重1000g）分置于2个2000mL锥形瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止（提取5次），干燥浸膏用甲醇反复溶解，得到甲醇可溶性干燥浸膏18g。用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱，得到各流份，再利用各种色谱技术分离得到2个化合物。
　　3 结果与讨论
　　3.1 化合物1的结构鉴定
　　无色针状结晶（丙酮），mp 145～150℃。10�硫酸显绿色，提示该化合物可能为甾体类化合物。1H-NMR (300MHz，CDCl3)谱高场区给出的六个甲基质子信号δ：1.14 (3H, s, H-19)、1.02 (3H, d, J = 6.6Hz, H-21)、0.92 (3H, d, J = 6.7Hz, H-28)、0.84 (3H, d, J = 6.6Hz, H-27 or H-26)、0.82 (3H, d, J = 6.6Hz, H-26 or H-27)、0.70 (3H, s, H-18)，提示其基本骨架可能为麦角甾烷；两个烯氢信号δ 5.19 (2H, m, H-22, 23)和三个连氧氢信号δ：4.21(1H, brs, H-6)、3.96 (1H, m, H-3)、3.32 (1H, brs, H-7)。13C-NMR (150MHz, CDCl3)谱中共给出28个碳信号，其中4个烯碳信号δ：135.5、134.5、132.0、126.9，可知化合物有两个双键，4个连氧碳信号δ：68.6、67.1、65.6、62.5提示结构中可能有四个羟基取代，其余的为20个化学位移小于δ 60的碳信号；根据这些信息，通过与文献对照，其核磁数据及理化性质与文献[3]报道一致，将此化合物鉴定为麦角甾-8(9)，22E-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇。
　　3.2 化合物2的结构鉴定
　　无色针状结晶（氯仿），mp 175～177℃，10�硫酸显绿色，提示该化合物可能为甾体类化合物。1H-NMR (300MHz，CDCl3)谱在高场区给出的六个甲基质子信号δ:1.01(3H,d,J= 6.6Hz,H-21)、0.92 (3H,d,J=6.8Hz,H-28)、0.90(3H,s,H-19)、0.85(3H,d,J=6.8Hz,H-27 or H-26)、0.84(3H,s, H-18)、0.81 (3H,d,J=6.8Hz，H-26 or H-27)，推测其基本骨架可能为麦角甾醇类；低场区δ5.22(1H, dd,J =15.3,7.8Hz, H-22)以及δ5.18 (1H,dd, J = 15.3, 7.8Hz, H-23)氢信号，提示结构中存在-CH-CH＝CH-CH-片段，且两烯氢为E构型，与22（E）-麦角甾烯侧链中烯键的化学位移值及偶合情况均比较相近，说明该化合物可能为麦角甾烯醇；另外低场区还给出了δ:6.52 (1H,d,J=8.5Hz,H-7)和6.26 (1H,d,J=8.5Hz,H-6)两个烯氢信号，是与其它质子无偶合关系的双键氢信号，说明此双键的两个烯丙位为季碳，推测此双键在甾体母核环内。13C-NMR(75MHz，CDCl3)谱中给出了3个连氧碳信号δ: 82.1、79.4、66.4，但是在氢谱中只有一个连氧碳上的氢信号δ3.99(1H,m,H-3)（可能为3-羟基麦角甾醇3位上的α-H信号），提示另外两个连氧碳为季碳。EI-MS中m/z：428 [M]+、410[M-H2O]+、396 [M-2O]+、363 [M-2O-H2O-CH3]+、303 [M-C9 H17]+、253 [M-H2O-2O-C9H17]+提示化合物结构中存在一个羟基，一个过氧桥和一个单烯侧链C9H17。EI-MS给出分子离子峰为m/z：428[M]+，结合氢谱与碳谱数据，推测分子式为C28H44O3。与文献波谱数据[4]进行对照基本一致，故推断该化合物为5α，8α-过氧麦角甾-6，22E-二烯-3β-醇。
　　参考文献
　　[1] 詹正高. 新药研究开发与应用[M]. 人民解放军出版社, 北京, 1998, 3-7.
　　[2] 陈代杰. 微生物药物的研究开发[J]. 中国医药工业杂志, 1997, 28(3):115-118.
　　[3] Li HJ, Lin YC, Vrijmoed LL, et al. A new cytotoxic sterol produced by an endophytic fungus from Castaniopsis fissa at the south China sea coast[J]. Chinese Chemical Letters, 2004, 15(4):419-422.
　　[4] 汤海峰，易杨华，姚新生，等. 褐藻铁钉菜中的甾醇成分[J]. 中国海洋药物, 2002, 1: 1-4.