新城疫检测规范

　新城疫检测规范

　1 范围

　 本规范规定了新城疫的采样、病毒分离鉴定、病毒血凝试验（HA）、病毒血凝抑制试验（AI）的检测技术要求。

　本规范适用于活禽及禽类产品的新城疫病毒分离、毒力鉴定的检验方法和结果判定等。

　2 引用标准

　下列标准包含的条文，通过在本规范中的引用而构成本规范的条文。在规范出版时，所示版本均为有效。所有规范都会被修订，使用本规范的各方应探讨、使用下列标准最新版本的可能性。

　GB 16550—1996 新城疫检疫技术规范

　OIE 《哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2000版）

　欧盟指令92／66／EEC 1992年7月14日

　行业标准送审稿 鸡新城疫检疫规程

　3术语

　3.1新城疫（ND）是家禽的一种急性传染病，其病原体新城疫病毒（NDV）在分类上属副粘病毒科副粘病毒亚科腮腺炎病毒属的一个成员。该病毒多呈圆形，直径100－500nm，基因组为单股，不忿节负极性RNA，有囊膜，可凝集人、鸡和小鼠等多种动物的红细胞。

　3.2 SPF鸡胚

　将无特定病原体（SPF）鸡所产的受精蛋孵化到试验要求的日龄。

　3.3 MDT

　鸡胚平均致死时间。

　3.4 ICPI

　脑内致病指数。

　3.5 IVPI

　静脉致病指数。

　3.6最小致死量（MLD）

　是指能引起所有用此稀释度接种的鸡胚死亡的最大稀释度。

　4 临床与病理学诊断

　4.1 典型临床症状

　精神沉郁或无任何症状而死亡；体温升高、食欲减退、精神萎顿、产蛋减少或停止；口腔和鼻腔分泌物增多，嗉囊胀满；鸡冠及髯发绀，呼吸困难、喉部发出“咯咯”声；下痢，粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；部分病鸡还出现神经症状，如偏头转颈，作转圈运动或共济失调。

　4.2 典型病理变化

　 口腔、咽喉部有粘液，咽部粘膜出血；腺胃乳头肿胀，挤压后有豆腐渣样坏死物流出，乳头有散在的出血点；肌胃角质下层有条纹状或点状出血点，有十见不规则溃疡，腺胃与肌胃搅接处有出血斑、条；小肠前段有大面积散在出血点，或肠粘膜有纤维性坏死并形成假膜，假膜下出现红色粗糙溃疡；盲肠和直肠皱褶处有出血，盲肠扁桃体（淋巴滤泡）出血坏死；气管粘膜充血、出血、气管内有粘液；心冠脂肪、心耳外膜及心尖脂肪上有针尖状小出血点。

　5 病原分离与鉴定

　5.1 病原分离

　5.1.1样品采集 无菌采取疑似ND病死鸡的大脑组织、气管、肺、肝、脾，装入灭菌小瓶中，盖好瓶盖并记录清楚（编号、采样时间、鸡群编号及发病的情况），样品立即送实验室处理或于－20℃以下冷冻保存；活禽可采其气管和泄殖腔拭子，将其放入盛有抗生素PBS（配制方法见附录A）的离心管中，样品应尽快处理或于4℃保存，但不超过4天。

　5.1.2样品前处理 取采集样品约1g放入研磨器中磨碎，加入5ml抗生素PBS制成1:5(W/V)悬液，并在室温下静置1～2h或37℃作用30min以确保灭菌，然后移入小离心管中，在不超过25℃的室温下，以2000r/min离心15min。上清液用于接种鸡胚。或以灭菌离心管盛装磨碎稀释的检样，置台式离心机中5000r/min离心10min，将上清液移入另一只灭菌离心管中8000r/min离心10min，取上清液进行下一项试验。如是棉拭样品，则将棉拭子充分捻动、拧干后除去拭子，样品液经2000r/min离心15min，取上清液作为接种材料。

　5.1.3鸡胚接种 用1ml注射器吸取无菌样品上清液接种9～10日龄SPF鸡胚的尿囊腔或绒毛尿囊膜，每份样至少接种5枚鸡胚，每胚0.2ml。接种后在35～37℃继续孵化4～5d，弃去24h内死亡的鸡胚。24h以后死亡的和濒死的以及结束孵化时存活的鸡胚置4℃冰箱，4～24h收集其尿囊液。以澄清无菌尿囊液作HA试验，测定HA效价，方法同6.2。HA阴性者，至少用SPF鸡胚再传代一次，然后再测定尿囊液的HA效价。通常需盲传2－3代。HA效价低于24视为未分离出新城疫病毒。

　5.2 HA试验

　 方法同6.2。

　5.3 HI试验

　 方法同7.2，判定尿囊液中是否有NDV。

　5.4 1日龄雏鸡ICPI测定

　取血凝滴度为24以上的新鲜感染鸡胚尿囊液，用灭菌生理盐水稀释10倍，脑内注射出壳后24～40h之内的SPF雏鸡，每份样品接种10只，每只接种0.05ml。并设生理盐水和标准毒株阳性对照。接种鸡隔离饲养，每24h观察一次，连续观察8d，每天观察即应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死亡鸡记作2（死亡鸡在死后每天观察都记作2），ICPI是指每只鸡8d内所有观察计分总数的平均数。

　 8天累计发病数×1＋8天累计死亡数×2

　 ICPI＝

　 8天累计观察鸡的总数

　结果举例见表1。

　表1 ICPI测定结果判定

　天数

　鸡

　 只

　数

　临诊

　症状

　1

　2

　3

　4

　5

　6

　7

　8

　8d累计

　鸡只数

　分值

　正常

　10

　4

　0

　0

　0

　0

　0

　0

　14

　1.4×0=0

　发病

　0

　6

　10

　4

　0

　0

　0

　0

　20

　20×1=20

　死亡

　0

　0

　0

　6

　10

　10

　10

　10

　46

　46×2=92

　总值

　80

　112

　ICPI=112/80=1.4

　5.5 6周龄鸡IVPI测定

　将血凝滴度为24以上的新鲜感染尿囊液，用灭菌生理盐水稀释10倍，翅静脉接种6周龄SPF小鸡，每只0.1ml。每份样品接种10只，并设生理盐水和标准毒株阳性对照，隔离饲养。每24h观察一次，连续观察10d，每天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，瘫痪鸡或有其他神经症状的记作2，死亡鸡记作3（死亡鸡在死后的每天观察都记作3）。IVPI是10d内每次观察每只鸡的记录总数的平均数。

　IVPI＝

　10天累计发病数×1＋10天累计瘫痪数×2＋10天累计死亡数×3

　10天累计观察鸡只总数

　 结果判定举例见表2。

　表2 IVPI测定结果判定

　 天

　鸡 数

　 只

　 数

　临诊症状

　1

　2

　3

　4

　5

　6

　7

　8

　9

　10

　10d累计鸡只数

　分值

　正常

　10

　2

　0

　0

　0

　0

　0

　0

　0

　0

　12

　12×0=0

　发病

　0

　4

　2

　0

　0

　0

　0

　0

　0

　0

　6

　6×1=6

　瘫痪

　0

　2

　2

　2

　0

　0

　0

　0

　0

　0

　6

　6×2=12

　死亡

　0

　2

　6

　8

　10

　10

　10

　10

　10

　10

　76

　76×3=228

　总值

　100

　246

　IVPI值=246/100=2.46

　5.6 鸡胚平均致死时间（MDT）测定

　将新鲜感染尿囊液，用灭菌生理盐水稀释成10-6-10-9五个不同稀释度，每个稀释度分别接种9～10日龄SPF鸡胚5只，每只尿囊腔接种0.1ml。已接种的鸡胚置于37℃孵育，剩余的稀释病毒液置于4℃，8h后每个稀释度分别接种另外5只鸡胚，每只0.1ml，于37℃继续孵化，每天早晚观察2次，间隔12h，连续观察7d，每次观察都应记录鸡胚死亡的时间。MDT是指最小致死量引起鸡胚死亡的平均时间。

　MDT＝

　(X小时死亡胚数×X小时＋Y小时死亡胚数×Y小时＋……)

　死 亡 胚 总 数

　5.7 结果判定

　5.7.1 ICPI值越大，NDV致病性越强。最强毒力病毒的ICPI接近2.0，而弱毒株毒力的ICPI值为0。

　5.7.2 IVPI值越大，NDV致病性越强。最强毒力的病毒的IVPI值可达3.0，弱毒株的IVPI值为0。

　5.7.3 MDT低于60h为强毒型NDV；MDT值在60～90h为中等毒力型NDV；MDT大于90h为低毒力NDV。

　6 NDV的HA试验

　6.1 材料与试剂

　6.1.1 器材:普通天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、吸头、96孔V型血凝反应板。

　6.1.2 磷酸缓冲盐水（PBS），配制方法见附录A。

　6.1.3 1%鸡红细胞悬液，配制方法见附录A。

　6.1.4 阳性NDV抗原（购自哈尔滨兽医研究所）。

　6.2 HA试验

　6.2.1 在96孔V型微量血凝反应板上，自第1孔至第11孔每孔加入25μlPBS。

　6.2.2 在第一孔中加入被检病毒液（感染尿囊液）25μl；充分混和后移出25μl至第二孔，依次类推作等量倍比稀释至第11孔，第11孔弃去25μl。

　6.2.3 设12孔为红细胞对照(阴性对照)，不加病毒液，只加入25μl PBS。

　6.2.4 上述每孔各加入25μl 1%鸡红细胞悬液，立即放在微型振荡器上摇匀，室温（约20℃）静置40min，或4℃ 60min，待阴性对照孔红细胞全部沉淀后，判定结果。血凝效价高于211时可继续增加稀释孔数。方法示意见表3。

　表3 NDV的HA试验程式

　（单位μl）

　孔 号

　1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

　稀释倍数

　21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 211

　PBS

　25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

　被检病毒液

　25 从第1孔吸取25μl放入第2孔，依次类推，倍比稀释直至第11孔，充分混匀后从第11孔弃去25μl。

　1%鸡红细胞

　25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

　感 作

　20℃左右 40min，或4℃60min

　结果举例

　＃ ＃ ＃ # # # # +++ ++ + － ＃

　 注：1) 12孔为红细胞对照。

　 2) ＃为完全凝集，+++ ++ +为不完全凝集，－为不凝集。

　注：另设一排阳性对照，操作过程同上，把“被检病毒液”换成“阳性NDV抗原”。

　能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的血凝效价。例如，表3所示，病毒血凝效价为27，即1:128。

　6.2.5 结果判定

　血凝程度用#、+++、++、+、-表示。“#”为完全凝集，红细胞均匀铺于孔底呈伞状；“+++”为大部分凝集，红细胞均匀铺于孔底，但孔底面中央有少量（约25%）红细胞沉积；“++”为半量凝集，红细胞在孔底面上分布不均匀，底面中央约有半量（50%）红细胞沉积，“+”为小部分凝集，孔底面上有少量红细胞分布，但大部分（约75%）沉积于孔底面中央；“—”为不凝集，红细胞全部沉积于孔底面中央，呈团状。结果以“#”为凝集判定终点，即能完全凝集鸡红细胞的最高稀释度为该受检病毒的血凝效价。将血凝板倾斜，从背侧观察，看红细胞是否呈泪珠状流下。滴度是指产生完全凝集（无红细胞流下）的最高稀释度。仅当对照成立时，判定结果方为有效。

　7 NDV的HI试验（病毒鉴定试验）

　7.1 材料与试剂

　7.1.1 器材同6.1.1。

　7.1.2 试剂同6.1.2。

　7.1.3 阳性抗NDV血凝抑制抗体（阳性血清）；阳性NDV抗原。

　7.1.4 4个血凝单位的病毒液制备：

　 根据5.1.1测定的病毒的血凝效价，判定4个血凝单位的稀释倍数。方法举例为：如病毒HA效价为29，其4个血凝单位为27，则将病毒稀释128倍即可。

　7.2 HI试验

　7.2.1 在96孔V型血凝反应板上，1-11孔各加入25μl PBS。12孔加入50μl PBS。

　7.2.2 第一孔加入25μl标准抗NDV血清，充分混和后移出25μl至第2孔，依次类推，倍比稀释至第11孔，第11孔稀释混和后弃去25μl，第12孔为红细胞对照孔。

　7.2.3 在1-11孔每孔加入25μl 4个血凝单位的待检病毒液，立即在微型振荡器上摇匀，室温（约20℃）静置不少于30min，或4℃ 不少于60min

　7.2.4 每孔各加入25μl 1%鸡红细胞悬液，置微型振荡器上摇匀后，室温（约20℃）静置40min，或4℃ 60min，这时红细胞对照孔应呈明显的纽扣状，方法示意见表4

　7.2.5 结果判定

　#为完全凝集，即凝集未被抑制；+++—+为不完全凝集，即凝集被部分抑制；—为不凝集，即凝集被完全抑制。能完全抑制4单位病毒凝集鸡红细胞的血清最高稀释倍数为阳性血清对被检病毒液的血凝抑制效价。例如，表4血凝抑制效价为27，即1：128。即将血凝板倾斜，从背侧观察，看红细胞是否呈泪珠状流下。滴度是指产生完全不凝集（红细胞完全流下）的最高稀释度。仅当对照成立时，判定结果方为有效。HI效价高于211时可继续增加稀释的孔数。

　表4 NDV的HI试验程式

　(单位μl)

　孔 号

　1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

　稀释倍数

　21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 211

　PBS

　25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50

　阳性抗NDV血清

　25 从第1孔吸取25μl放入第2孔，依次类推，倍比稀释直至第11孔，充分混匀后从第11孔弃去25μl。

　4个血凝单位病毒

　25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

　感 作

　20℃左右 40min，或4℃60min

　1%鸡红细胞

　25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

　感 作

　20℃左右 40min，或4℃60min

　结果举例

　－ － － － － － － ++ +++ ＃ ＃ ―

　注：1) 12孔为红细胞对照。

　 2) ++++ 为完全凝集，即凝集未被抑制；+++ ++ ＋为不完全凝集，即凝集被部分抑制；

　 － 为不凝集，即凝集被完全抑制。

　注：另设一排阳性对照，操作过程同上，把“4个血凝单位的待检病毒”换成“4个血凝单位的阳性NDV抗原”。

　8 结果判定

　8.1 疑似新城疫

　有典型症状或典型病变。

　8.2 确诊新城疫

　从疑似病例的样品中分离到血凝滴度大于等于24的病毒， 这种血凝性能被新城疫标准阳性血清有效抑制，分离毒的ICPI大于或等于0.7可判断为中等或强毒新城疫感染。

　附录A

　（规范性附录）

　A.1 0.85%生理盐水的配制

　氯化钠 8.5g

　蒸馏水加至1000ml

　分装于 250ml瓶中，121℃ 15min高压灭菌备用。

　A.2磷酸缓冲盐水（PBS）配制

　氯化钠NaCl

　8.0g

　氯化钾KCl

　0.2g

　磷酸氢二纳Na2HPO4

　1.44g

　磷酸二氢纳KH2PO4

　0.24g

　溶于800ml纯水中，用HCl调pH至7.0～7.4，加纯水至1000ml，分装，121℃（15磅）20min高压灭菌。

　A.3 1%鸡红细胞悬液配制

　采集三只健康公鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3至4倍量生理盐水，以2000r/min离心15min，去掉血浆和白细胞层，再加生理盐水，混匀、离心，反复洗涤3次，最后吸取压积红细胞用生理盐水配成1%（V/V）悬液。

　A.4抗生素PBS的配制

　取500ml灭菌PBS，加入下列抗生素，使其终浓度如下：

　青霉素 2000单位/ml；

　链霉素 2mg/ml；

　庆大霉素 0.05mg/ml；

　制菌霉素 1000单位/ml；

　注：粪便和泄殖腔棉拭样品要求抗生素浓度提高5倍。