单核巨噬细胞【单核巨噬细胞集落刺激因子对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响】

　　[摘要]目的:研究单核巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, GMCSF)对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响,探讨其促进创面愈合的机制并为临床准确定量应用该因子促进创面愈合提供理论依据。方法:分别应用浓度为0、25、50、75、100、150ng/ml GMCSF培养液孵育离体培养的人皮肤成纤维细胞,作用24h后四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的活性。选择最适浓度GMCSF干预细胞,用流式细胞仪检测成纤维细胞的周期变化;应用ELISA检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原合成情况。结果:GMCSF在浓度为25～100ng/ml之间对人皮肤成纤维细胞有明显的促增殖作用,其中以50/ml最为显著;成纤维细胞在最适浓度GMCSF干预24h后,细胞大多处于DNA合成前期和合成期;与空白组比较,GMCSF组Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌明显增加(P 　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料和仪器:DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco,美国);四甲基偶氮唑蓝MTT及DMSO(上海鼎国生物技术有限公司);单核巨噬细胞集落刺激因子(欣百诺生物有限公司);Ⅰ型和Ⅲ型胶原ELISA试剂盒(R&D,美国);FACSCalibur 流式细胞仪(BD,美国);细胞培养箱(Heal Force);离心机(Beckman)。
　　1.2 方法
　　1.2.1人皮肤成纤维细胞的原代分离与培养:取我院泌尿外科儿童包皮环切术后包皮(患者知情同意)进行原代分离培养及鉴定[4]。本实验选用第4代生长状态良好且处于对数生长期的人皮肤成纤维细胞细胞用于研究。
　　1.2.2 MTT法检测人皮肤成纤维细胞增殖活力:收集处于对数增殖期的第4代人皮肤成纤维细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,制成单细胞悬液,血细胞计数板计数后,以2×103个/ml的密度接种于96孔培养板中,每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养24h后,小心吸弃培养液,每空加入100μl无血清培养液平衡12h。然后分别加入含有GMCSF浓度为0,25,50,75,100,150ng/ml无血清的DMEM培养液,每组8个复孔,继续培养24h。每空加入MTT(5mg/ml)20μl。37℃,5%CO2继续孵育4h,终止培养,吸弃孔内培养上清液,加入DMSO150μl,振荡10min,在酶联免疫检测仪上测定出各孔的吸光度(A)值。
　　1.2.3 流式细胞仪检测人皮肤成纤维细胞周期:取对数生长期细胞,加入含有GMCSF浓度为75ng/ml的无血清培养液,实验设GMCSF组及空白组,培养24h后,血细胞计数版计数,制成1×106个/ml细胞悬液,1 000r/min离心10min,弃上清,加入PBS洗一次,加入4℃的70%乙醇固定,4℃冰箱保存。然后取出所固定的细胞,离心弃去乙醇,用PBS重悬细胞,离心,弃上清,用PI染液(含RNAase酶),4℃避光染色30 min。用流式细胞仪测定人皮肤成纤维细胞倍体。采用多参数细胞分析软件处理,对样本进行DNA含量及细胞周期分析。
　　1.2.4 夹心ELISA法检测人皮肤成纤维细胞培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原分泌:取对数生长期人皮肤成纤维细胞,实验设GMCSF组及空白组。其中GMCSF组加入浓度为75ng/ml的无血清培养液,空白组加入相应量PBS溶液。各组细胞孵育24h后终止培养。取终止培养后的培养液,离心去沉淀,取上清。Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量测定按照试剂盒说明书操作,每组设3个复孔,在450nm波长酶标仪上测各孔吸光度值。根据标准曲线换算成Ⅰ、Ⅲ型胶原的浓度。
　　1.2.5统计学分析:所有计量资料均以x±s表示,采用SPSS11.0软件进行方差分析,以α=0.05作为水准,P 　　目前GMCSF作为创面外用药虽然已经应用于临床[10-11],但是对于使用多少浓度才能够最大限度促进创面的愈合尚存在争议,对于促进创面愈合的详细机制也尚未完全清楚。本研究从细胞水平确定了GMCSF对人皮肤成纤维细胞促增殖作用的最适浓度,为临床准确用药提供了可靠的依据;并提示GMCSF促进成纤维细胞增殖及胶原的表达为其加速创面愈合的机制之一。至于GMCSF通过何种机制促进人皮肤成纤维细胞的增殖及胶原表达,这将有待于下一步深入的研究。
　　
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　　[收稿日期]2010-04-10 [修回日期]2010-06-10
　　编辑/张惠娟