载脂蛋白E基因敲除鼠与动脉粥样硬化的研究|载脂蛋白E

　　[摘要]载脂蛋白E(apolipoprotein ,APOE)是血浆脂蛋白的重要组成成分,在脂质代谢中发挥着重要的作用。载脂蛋白E基因的缺失或变异均会引起体内的代谢异常或组织器官的功能障碍,从而导致一系列的疾病和并发症。载脂蛋白E基因敲除小鼠是目前研究动脉粥样硬化发生机制的最常用的动物模型之一,尤其是用于易损斑块动物模型研究。本文对载脂蛋白E基因敲除小鼠粥样硬化斑块病理特点、饮食对其AS的影响、调脂药物的研究情况,及有氧运动对斑块的作用等进行了综述。
　　[关键词]载脂蛋白E基因; 敲除小鼠; 动脉粥样硬化
　　[中图分类号] R543.1+2[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515(2010)-10-022-02
　　
　　Effect of APOE-gene Knockout Mice and Research of Atherosclerosis
　　Nie saiZhao shui-ping(auditing)
　　(Cardiology of 2nd Xiangya Hospital of Central South University,Hunan-changsha, 410011)
　　[Abstract]APOE is an important component of plasma a lipoproteins, and plays significant roles in lipoprotein metabolism. The absence or mutation of APOE may induce abnormal lmetabolism in vivo and dysfunction of organs, and then lead to a series of diseases and complications. APOE-knockout mice is one of the best models for research on mechanism of atherosclerosis, which became a popular model used in studies on vulnerable plaques. This article explore pathologic characteristics of atherosclerotic plaques, high fat diet, aerobic movement and application in pharmacological research about APOE gene knockout mice.
　　[Keywords] Apolipoprotein E; Gene knockout; Atherosclerosis; Mice
　　
　　载脂蛋白E(ApoE)于1973年发现,与已知氨基酸序列的载脂蛋白相比,其精氨酸含量较高,故曾称为富含精氨酸的载脂蛋白(ARP)。1975年,Utermann建议根据字母顺序将其命名为ApoE。1992年美国洛克菲勒大学生化遗传和代谢实验室和北卡罗来纳大学病理遗传实验室应用胚胎干细胞基因敲除技术,成功培育出载脂蛋白E基因敲除小鼠[1]。载脂蛋白E作为配体,有助于乳糜微粒和极低密度脂蛋白的清除。因此,缺乏ApoE则会导致血液循环中脂蛋白代谢障碍,易于沉积动脉壁内,引起动脉粥样硬化(AS)斑块。ApoE基因敲除小鼠易形成严重高脂血症及AS病灶,所以广泛应用于AS的研究。
　　1ApoE基因敲除小鼠AS病灶的病理特点
　　对正常饮食下的ApoE基因敲除小鼠进行观察[2],发现血浆总胆固醇(TC)含量比同期正常小鼠高4-5倍,随着时间延长,可出现不同的病变特征。5-6周时动脉内皮上有单核细胞黏附,并向内皮下移动;10周时脂质条纹形成;15周时可见斑块形成,其内可见泡沫细胞和平滑肌细胞;20周时则有胶原和弹性纤维包饶的平滑肌细胞组成的纤维帽覆盖在坏死核心表面,形成成熟的斑块。随着时间延长,可出现钙化、增生的纤维帽,8个月左右冠脉动脉口处由于粥样硬化斑块的发展形成严重闭塞。这种小鼠虽然病变严重,但仍能在一般条件下存活。
　　将ApoE基因敲除小鼠分为低脂饮食组与高脂饮食组,分别在6、8、10、15、20、30、40周时,观察血管组织形态变化,发现AS各阶段的病理表现均存在于这种小鼠,与其他AS小鼠模型比较,ApoE基因敲除小鼠不仅能够在瓣膜基底,而且能够在所有胸腹动脉中形成广泛的粥样硬化病变,如:主动脉分支、颈动脉、肺动脉等。所以,ApoE基因敲除小鼠的AS病变发展同人类极其相似[3]。Cullen[4]研究认为,因为动物本身的特性及诱导斑块破裂和检查手段的限制及不确定性,使其不能够准确的反映或代表复杂的人类粥样硬化斑块,而ApoE基因敲除小鼠的自发破裂与人类的形似性更好。
　　42-60周龄的ApoE基因敲除小鼠,头臂段动脉存在富含胶原的纤维脂质斑,斑块内有坏死核和出血及被包埋的多层损伤,认为后者是由于反复斑块破裂后修复所致[5]。早期的钙化,对斑块破裂有促进作用,斑块在不同密度组织的交界面最易破裂;而当钙化融合后,这种交界面减少,破裂发生率也降低了[6]。因此,钙化对于斑块破裂是把“双刃剑”。
　　2膳食和遗传背景对APOE基因敲除小鼠AS病灶的影响
　　动脉粥样硬化小鼠模型中,经常用高脂饮食来诱导或加快AS的形成。已知不同剂量或不同类型的脂肪酸、加用或不加用胆固醇等,对于模型小鼠的血脂水平,或动脉粥样硬化的形成都具有重要的影响。
　　一般认为,动物模型发生和形成典型的AS病变,血胆固醇水平至少持续保持在300mg/dL以上。应用最多的是Getz等[7]认为的西方膳食(Western-type diet),包含有21%脂肪和0.15%胆固醇的膳食,可以使ApoE基因敲除小鼠胆固醇水平短时间内达到并持续保持1500mg/dL(38.79mmol/L)以上甚至更高。且研究发现,西方膳食与18%脂肪和0.25%胆固醇的膳食相比,在增高血脂水平及在主动脉弓部或无名动脉形成动脉粥样硬化损害的作用相似,同时0.15%和0.5%胆固醇的膳食,在诱导动脉粥样硬化损害形成上没有差别。
　　有研究表明,尽管ApoE基因敲除会导致高脂血症,但不同基因表型或不同遗传背景决定ApoE基因敲除小鼠的形成的AS严重程度。给予相同的高脂饮食,杂合子ApoE基因敲除小鼠(apoE+/-)血脂水平与野生型小鼠比较无显著差别,但AS损害面积是野生型小鼠的10倍左右,而对于纯合子ApoE基因敲除小鼠(apoE-/-),血浆胆固醇水平会更高(>2000mg/dL),大动脉的AS损害面积是杂合子apoE+/-的50倍。比较C57BL/6和FVB/NJ来源的ApoE基因敲除小鼠,发现给与相同膳食,FVB/NJ背景的小鼠血胆固醇浓度相对较高,C57BL/6背景的小鼠主动脉AS损害面积是FVB/NJ背景的8倍[8]。
　　3ApoE基因敲除小鼠斑块产生机理
　　ApoE基因敲除小鼠的血浆中总胆固醇浓度明显增高,三酰甘油水平亦比正常小鼠高68%,并不受年龄和性别的影响;但其高密度脂蛋白(HDL)却只有正常小鼠的45%。正常小鼠的胆固醇主要存在于HDL中,而ApoE主要存在于乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中;但是敲除ApoE基因后,胆固醇就不再主要存在于HDL中,而是在VLDL[9]。此时VLDL中大量的胆固醇就不能从小鼠体内降解,而在体内蓄积,导致动脉粥样硬化。
　　利用ApoE基因敲除小鼠研究极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)的致动脉粥硬化作用,并从形态学方面证实,该模型易发生动脉粥样硬化,主要是VLDL和IDL从体内清除的延缓。并有研究显示,VLDL和IDL作为导致小鼠动脉粥样硬化的脂蛋白,以不依赖ApoE的方式直接作用于巨噬细胞,使之在动脉壁损伤处转化为泡沫细胞。
　　4ApoE基因敲除小鼠与AS的干预研究
　　利用此动物模型,可观察各种抗AS治疗措施的疗效。已发表了许多相关研究结果,大致可分两大类干预方法:降脂和非降脂措施。
　　4.1 他汀类药物的作用
　　利用此动物模型,Johnson等[10]观察到,普伐他汀(40mg/kg.d)可减少早期(9周)斑块的破裂,而且在不稳定斑块形成后依然有效,但与降低血浆胆固醇浓度无关。Taral等[11]研究显示, 辛伐他汀具有抗炎、抑制钙化及稳定斑块的作用。他汀类药物的调脂作用仍然具有争议,不同的研究结果皆然不同,有解释认为与给药方式不同有关。但高、低剂量辛伐他汀的调脂效果差异不明显,这可能与应用时间较短有关[12]。晏沐阳等[13]研究显示,辛伐他汀的应用可以小鼠的动脉粥样硬化斑块面积减小,降低血清中LDL-C和TC的水平,同时还有他汀类药物降低炎性反应,抑制金属蛋白酶活性等独立于调脂以外的作用。
　　4.2 非他汀调脂药物的作用
　　Zhang等[14]给予ApoE基因敲除小鼠口服普罗布考(0.5%,wt/wt),发现该药在降低血浆TC的同时,使高密度脂蛋白(HDL)和ApoAI明显降低。然而,主动脉AS斑块发展的速度比非用药组明显加快,面积约非组的2-4倍。组织学分析,普罗布考组小鼠病变以纤维组织增生为主,而非泡沫细胞,通常认为这种现象与局灶性炎症反应和动脉瘤扩张有关,而且给予高脂饮食的正常小鼠,普罗布考亦可加快粥样病变的发展。提示通过普罗布考降低血浆TC并非抗AS的有效措施。
　　4.3 非调脂药物的作用
　　Bourassa等[15]研究内源性和外源性雌激素对ApoE基因敲除小鼠对AS的影响。发现内源性雌激素较外源性雌激素能明显减轻AS病变,这种现象可能与内源性雌激素影响血浆脂蛋白的水平有关。治疗糖尿病药物罗格列酮可以减少巨噬细胞的浸润,同时减少新生内膜的形成,具有直接抗动脉粥样硬化的作用[16]。钙离子通道拮抗剂-拉西地平可以通过抗氧化作用和血管活性作用来抑制动脉粥样硬化的发生发展[17]。非洛地平及厄贝沙坦可能是通过阻断氧化应激反应抑制动脉粥样硬化发生发展[18,19]。而单独运用哌唑嗪(7.5mg/kg.d)既未能明显减缓小鼠AS的发展,也不能有效降低血压;氯沙坦(20或30mg/kg.d)除轻微降低血压外,对AS基本无影响。然而,两种药物同时使用时小鼠的AS斑块和血压都有了显著的降低,但以上方法在用药过程中对血浆TC都无明显影响[20]。
　　4.4 有氧运动的作用
　　Napoli等[21]研究了中度有氧运动(游泳)联合代谢治疗(含1.0%Vitamin E普通饮食、含0.05% Vitamin C和6%L-精氨酸饮水),对6周龄ApoE基因敲除小鼠长期的作用,发现,任何一种治疗都可以缓慢AS的形成,并联合治疗与单独任意一种干预方式相比,更能明显的减少AS损害和自发斑块破裂率,以及提高生存率,认为早期干预是必要的,有益的。在跑台上进行中等强度有氧运动的ApoE基因敲除小鼠的TC、TG和LDL-C和ApoB水平显著降低,AS斑块面积明显减少,有氧运动和低脂饮食两种结合的作用大于单独有氧运动和低脂饮食的作用,两者可以起协同加强的作用[22]。
　　 ApoE在脂质代谢、心血管疾病、神经系统病变和糖尿病及其并发症等方面的研究已经广泛开展,但是ApoE在这些病理生理过程中发挥的作用及其机制并不十分清楚,尚需要进一步研究。然而,ApoE基因敲除小鼠所致的AS模型缘于遗传因素损伤,其病变更接近人类AS,相对于进食高脂饲料而发生AS的动物具有自然发生、渐进发展、病理形态典型等特点,为研究AS发病机理和干预措施提供了良好的实验平台,开拓了广阔的研究前景。
　　参考文献
　　[1] Plump AS, Smith JD, Hayek T et al.Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES Cells [J] . Cell, 1992,71 (1):343-353.
　　[2] Sunny H. Zhang, Reddick RL, Piedrahita JA, Maeda N et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking aopolipoprotein E [J]. Science, 1992, 258(10):468-471.
　　[3] Yutaka Nakashima, Audrew S, Plump, Elaine W, Raines, et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atheroslerosis throughout the arterial tree [J]. Arteriosclerosis and Thrombosis, 1994, 14(1):133-140.
　　[4] Cullen P, Baetta R, Rellosta S, et al. Rupture of the atherosclerotic plaque :does a good animal model exist? [J] . Arteroc Thomb Vasc Biol, 2003,23(4):535-542.
　　[5] Rosenfeld ME, Polinsky P, Virmani R, et al. Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000,20(12):2587-2592.
　　[6] Abedin M, Tintut Y, Demer LL, Vascular calcification: mechanisms and clinical ramifications [J] . Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24(7):1161-1170.
　　[7] Getz GS, Reardon CA, Diet and Murine Atherosclerosis [J]. Arteriosclerosis, Thombosis and Vasular Boilogy, 2006,26(2):242-249.
　　[8] Reardon CA. Getz GS. Mouse models of atherosclerosis [J]. Cun Opin Lipidol, 2001,12(2):167-173.
　　[9] Jawien J, Nastalck P, Korbut R. Mouse modes of experim ental atherosclerosis [J]. J Physiol Pharmacol, 2004,55(3):503-517.
　　[10] Johnson J, Carson K, Williams H, et al. Plaque rupture after short periods of fat feeding in the apolipoprotein E-knockout mouse: model characterization and effects of pravastatin treatment [J]. Circulation, 2005,111(11):1422-1430.
　　[11] Taral P, Mehdi S, Deepak B, A review of high-dose statin therapy: targeting cholesterol and inflammation in atherosclerosis. Eur Heart J,2007,28:664-672.
　　[12] Blackburn DF, Dobson RT, Blackburn JL,et al. Cardiovascular morbidity associated with nonadherence to statin therapy. Pharmacotherapy, 2005,25:1035-1043.
　　[13] 晏沐阳,翟永志,彭勃等. 辛伐他汀消退老年载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的观察。中华老年心脑血管病杂志,2008,10(5):163-363.
　　[14] Zhang-SH, Reddick RL, Avdienich E, et al, Paradoxical enhancement of atherosclerosis by probucol treatment in apolipoprotein E- deficient mice [J] . J- Clin- Invest, 1997,99:2858-2866.
　　[15] Bourassa-PA, Milos P M, Gaynor BG, et al. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice [J] . Proc-Natl-Acad-Sci-USA,1996,93(19):10022-10027.
　　[16]Levi Z, Shaish A, Yacov N, et al. Rosiglitazone( PPARγ-agonist) attenuates atherogenesis with no effect on hyperglycaemia in a combined diabetes-atherosclerosis mouse model [J]. Diabetes Obes Metab, 2003,5(1):45-50.
　　[17] Kyselovic J, Martinka P, Batova Z, et al. Calcium channel blocker inhibits western-type diet-evoked atherosclerosis development in ApoE-deficient mice [J]. J Pharmacol Exp Ther,2005,315(1):320-328.
　　[18] 姚瑞,程翔,廖玉华等.非洛地平对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的影响。临床心血管杂志,2008,24(9):698-701.
　　[19] 姚瑞,程翔,廖玉华等.厄贝沙坦对高胆固醇饮食载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块及NAD(P)H氧化酶的影响。中国药理学通报,2008,24(10)1289-1292.
　　[20] Makaritsis KP, Gavras H, Du Y, et al. Alphal-adrenergic plus angiotensin receptor blockade reduces atherosclerosis in apolipoprotein E-deficiemt mice [J]. Hypertension, 1998,32:1044-1048.
　　[21] Napoli C, Williams-Ignarro S, de Nigris F, et al. Physical training and metabolic supplementation reduce spontaneous atherosclerotic plaque rupture and prolong survival in hypercholesterolemic mice [J]. PNAS,2006,103(27):10479-10484.
　　[22] 陈近利,陈吉棣.有氧运动和膳食脂肪对ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响.中国运动医学杂志,2002,20(1):5-8,15.