腹壁成形术【ADSC-bFGF对大鼠腹壁成形术后TRAM皮瓣活性的影响】

　　[摘要]目的:研究脂肪来源间充质干细胞复合碱性成纤维细胞生长因子(ADSC-bFGF)对大鼠腹壁成形术后腹部横行腹直肌肌皮瓣(TRAM flap)活性的影响。方法:体外分离、培养、鉴定SD大鼠ADSC。建立大鼠腹壁成形术模型。分别给予A组(ADSC-bFGF)、B组(ADSC)、C组(纤维蛋白凝胶)及D组(生理盐水)。所有动物腹壁成形术后一个月建立TRAM皮瓣模型。术后7天测定皮瓣成活面积、组织学观察和微血管密度(MVD)。结果:A、B、C、D四组的皮瓣存活率分别为(69.40±2.81)%、(66.19±2.32)%、(46.69±2.41)%和(43.77±3.55)%;A、B、C、D四组的毛细血管密度(根/mm2)分别为:(65.30±2.19)根/mm2;(59.99±2.41)根/mm2;(44.71±2.21)根/mm2;(42.44±3.22)根/mm2。皮瓣成活率A组与B组差异有意义(P 　　
　　1材料
　　1.1 设计:采取随机,对照,动物实验。
　　1.2 时间及地点:于2010-04至2010-07在哈尔滨医科大学动物实验室完成。
　　1.3 实验材料:健康纯种成年雄性SD大鼠,质量为250～280g(哈尔滨医科大学动物实验中心提供),共28只。DMEM-F12培养基(美国Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青公司,中国),CD31单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),PV-6000通用型二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司),纤维蛋白凝胶(上海利康瑞生物工程有限公司),贝复济(珠海亿胜生物制药有限公司)。
　　
　　2方法
　　2.1 脂肪来源间充质干细胞(Adipose derived stromal cell ,ADSC)的体外分离、纯化、扩增培养:取250～280g的雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧腹股沟脂肪垫,剪碎脂肪。0.075%Ⅰ型胶原酶消化1h,用含血清的DMEM-F12培养液终止消化,1500 r/min,离心10min,用含有10%胎牛血清的DMEM重悬。按3×105/cm2的细胞密度接种于25cm2塑料培养瓶,置于37℃,5%C02饱和湿度的孵箱内培养。72 h更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3天换液1次。通过反复传代可得到纯化的ADSC(图1)。
　　2.2 实验分组及治疗:实验动物随机分为4组,每组7只。①A组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(ADSC+ bFGF);②B组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(ADSC);③C组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(纤维蛋白凝胶);④D组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(生理盐水)
　　2.3 动物模型构建
　　2.3.1 腹壁成形术模型及治疗:健康纯种成年雄性SD大鼠,250～280g。水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉(0.3ml/100g),麻醉完毕,将SD大鼠采取仰卧位固定在大鼠板上。
　　腹壁成形术的切口设计线呈倒梯形状。先描画出剑突的位置,在鼠尾方向离剑突1cm的位置设计出与腹正中线垂直的5cm上底线。向下0.5cm再设计出与该线平行的水平线。尾部方向的基底线长2cm,距上底线3cm(图2A)。0.5%碘伏消毒大鼠腹部术区,铺无菌洞巾。沿切口线切开大鼠皮肤、皮下至深筋膜层,沿头尾方向在深筋膜层掀起皮瓣,离断进入皮肤的穿支。标出两侧腹直肌腱膜,其大小为3cm×0.5cm,距腹正中线0.25cm。对A、B、C、D四组分别用ADSC-bFGF悬液(细胞为第四代)、ADSC细胞悬液(第四代)、纤维蛋白凝胶和生理盐水,分四点注射到腹直肌上(图2B)。每点均为0.1ml,总量为0.4ml/只。然后将0.5cm×5cm的皮条切除。缝合切口。实验完毕后单笼饲养,麻醉清醒后,自由供应饮食饮水。每日观察大鼠的生活状态。
　　2.3.2 TRAM模型建立:腹壁成形术后1个月,所有实验动物均构建TRAM模型。
　　TRAM皮瓣位于剑突下1cm,大小为10.5cm2。沿设计线切开皮肤后,将皮瓣从左侧的蒂部向腹白线分离。将右侧的皮瓣从外侧缘向腹直肌分离。沿腹白线和腹直肌外测沿作纵切口,将头侧的腹直肌切断,制作成以右侧腹直肌为蒂,腹壁下动脉供血的皮瓣(图3)。
　　2.4 皮瓣坏死的鉴定:在TRAM皮瓣术后7天进行皮瓣坏死面积的评估(图4)。术后7天水合氯醛10ml/kg腹腔注射处死动物。即刻切取全部腹壁组织(包括腹直肌),用硫酸纸描绘皮瓣成活区域范围并扫描入计算机。应用Adobe Photoshop CS2软件测量皮瓣成活面积,以成活面积/设计面积的比值表示皮瓣成活情况。
　　2.5 组织标本取材:根据Lineaweaver等[3]的方法,将TRAM皮瓣分为四个区:Ⅰ区,腹中线到右侧腹直肌外侧缘间的区域;Ⅱ区,腹中线到左侧腹直肌外侧缘间的区域;Ⅲ区,右侧腹直肌外侧缘到右侧皮瓣边缘的区域;Ⅳ区,左侧腹直肌外侧缘到左侧皮瓣边缘的区域。无菌条件下切取大鼠皮瓣小块约0.5cm×0.5cm大小组织,分别取距皮瓣各区中间的组织。用4%甲醛固定24h后制成石蜡病理切片;一部分切片用于苏木素-伊红染色,观察组织病变情况;另一部分则用于免疫组化检测。
　　2.6 微血管密度(microvessel density,MVD)检测:标本石蜡切片后HE染色,40倍光学显微镜在皮下组织中随机取6个视野计算微血管数取平均值,根据每个视野0.1885mm2换算成每mm2血管数做统计学处理。
　　2.7 统计学处理:用SPSS 13.0软件进行统计学处理,数据采用各组的平均值±标准误表示,各组间比较采用t检验,P0.05)(表1,2)。
　　3.2 HE染色分析:术后第7天,切取的皮瓣组织病理切片,HE染色可见,A、B两组表皮完整有轻度萎缩,组织内轻度炎症浸润,有较高密度的小血管分布,内有红细胞充盈,纤维组织细胞增生明显。C、D两组皮瓣萎缩明显,皮下组织有水肿,炎细胞浸润明显,新生血管数目较少,皮下纤维增生,排列不规则 (图5)。
　　3.3 微血管密度(MVD)测量:各组动物术后第7天皮瓣内MVD:(65.30±2.19)根/mm2;(59.99±2.41)根/mm2;(44.71±2.21)根/mm2;(42.44±3.22)根/mm2。皮瓣微血管密度A组与B组差异有显著性意义(P0.05)(表3、4)。
　　3.4 免疫组化结果:注射ADSC-bFGF组组织内血管内皮CD31呈阳性表达,染色的血管内皮标记出微血管,血管内皮细胞浆内褐色抗原抗体复合物沉积,甚至可见抗原抗体复合物呈带状围绕血管腔,而生理盐水组不明显(图6)。
　　
　　4讨论
　　大鼠腹部血管结构同人体相似,大鼠TRAM皮瓣模型已证实是可靠的实验动物模型。我们采用了de Freitas等[4]提出的腹壁成形术后TRAM皮瓣模型,选择以腹壁下动脉为供应血管,右侧低位带蒂的TRAM皮瓣。尽管其在大鼠上并不是最理想的动物模型,但它更贴近于人的TRAM皮瓣。血管蒂的肌皮穿支范围仅限于Ⅰ区。结果模型组中Ⅰ区的全部、II区及Ⅲ区的小部份成活,皮瓣Ⅳ区的全部、II及Ⅲ区大部份坏死。所有这这些动物模型的皮瓣成活区域[(4.49±0.44)cm2]及成活率[(42.79 ±1.61)%]比较恒定。具有较好的重复性。因此以腹壁下动脉为蒂的大鼠腹壁成形术后TRAM皮瓣模型是一个比较稳定和成功的缺血皮瓣动物模型。
　　目前,基因疗法被认为是促进腹壁成形术后TRAM皮瓣存活的理想疗法。其研究主要集中在应用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)促进微血管生成,但VEGF也是肿瘤血管生成的重要调节因子,在多种恶性肿瘤的生长、转移中起着极为重要的作用,而且再造乳房又在乳腺癌的术野之中[5]。因此,将VEGF用于乳腺癌术后乳房再造的患者以促进再造乳房皮瓣成活有促进肿瘤生长的风险,是不合适的,需要寻找新的促进皮瓣血供和修复的手段。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 是一种多功能细胞生长因子,是成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的高效促生长剂,能够强烈促进新生毛细血管的形成[6-7]。刘斌[8]等对大鼠背部随意皮瓣应用bFGF后,发现新生微血管的数量增加,皮瓣成活面积增大。Wong等[9]研究在大鼠腹直肌肌皮瓣术后bFGF的表达,发现bFGF能促进血管增生,使大鼠皮瓣存活面积显著增加。
　　ADSC容易获得和培养,具有多向分化潜能,在体外容易扩增和长期稳定表达等优点在创伤修复、组织缺血的血管生成和组织工程方面起了非常重要的作用。有研究发现ADSC移植能促进大鼠脑缺血缺血区微血管的生成,其机制可能与促进bFGF和VEGF的表达有关[10]。Moon等评估了ADSC对裸鼠后肢局部缺血模型新生血管形成和血流的影响,发现实验组血流指数和血管密度均显著高于对照组[11]。
　　本实验通过VEGF复合体外培养的SD大鼠ADSC,利用基因治疗和细胞治疗的协同作用,在建立腹壁成形术时注射ADSC-bFGF,以期在建立TRAM皮瓣时新生血管的数量能达一定水平。注射后第37天(术后第7天)证实基因和细胞协同治疗能有效地增加皮瓣成活面积及微血管密度。我们的研究已经初步表明,ADSC-bFGF具有更强大的促进缺血组织血管新生作用,能有效的增加腹壁成形术后TRAM皮瓣的成活面积。因此,联合治疗可作为治疗腹壁成形术后TRAM皮瓣缺血的首选。但是要将ADSC-bFGF治疗缺血皮瓣的方法真正应用于临床,尚需大量的工作:①bFGF对ADSC的生物效应研究;②ADSC-bFGF促进皮瓣血管的具体机制研究;③治疗的稳定性、可控性及安全性等。这些将是我们以后进一步开展的课题。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2010-06-16 [修回日期]2010-08-10
　　编辑/张惠娟