头皮毛囊堵塞【胎儿头皮毛囊内黑素细胞HMB-45和NKI/beteb的表达】

　　[摘要]目的:观察黑素细胞在胎儿头皮内的定位。方法:获取胎儿头皮(胎龄7月,畸形引产,死亡2h),制备冰冻切片,分别用HMB-45和NKI/beteb抗体进行免疫荧光染色和免疫组化染色,激光共聚焦显微镜和倒置显微镜观察摄片。结果:NKI/beteb阳性细胞主要位于胎儿头皮的毛囊外根鞘隆突区,也见于毛球处、表皮基底部。HMB-45阳性细胞主要存在于毛球部、毛母质和表皮基底部,外根鞘区表达则阴性。结论:胎儿头皮毛囊内存在不同状态的黑素细胞,位于毛囊外根鞘隆突区的黑素细胞是黑素母细胞。
　　[关键词]毛囊;胎儿;隆突;黑素细胞
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)07-1003-04
　　
　　Location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp
　　LI Hong-zhou,XUE Dong-zhang,ZHANG Ru-zhi,ZHU Wen-yuan,ZHANG Jing,CHEN Ze-nong,ZHAO Hao
　　(1. Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Hefei 233004,Anhui,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo explore the location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp. MethodsThe scalp was from a died fetus (fetal age of 7 months, induction delivery due to developmental abnormity ) and prepared for frozen sections, thenwhich respectively received immunofluorescent and immunofluochemical staining with HMB-45 and NKI/beteb antibodies. The stain results was observed and photographed by confocal microscope and the inverted microscope, respectively. ResultsThe positive cells stained by NKI/beteb antibody were mainly located at the bulge regions in the outer root sheath (ORS) of hair follicle, some in the hair bulbs and the epidermal basilar parts. The HMB-45 positive cells were present in the hair bulb, the hair matrix and the epidermal basilar parts, but not in ORS.ConclusionThere are melanocytes with different status in hair follicle. Melanocyte at the bulges of ORS is melanoblast.
　　Key words:hair follicle; fetus; bulge; melabocyte
　　
　　毛囊是一个独特的皮肤附属器, 其色素单位的自我更新取决于毛囊内的黑素干细胞(melanocyte stem cells, MSCs)及其子代细胞。毛囊MSCs特征如下:具备不成熟、慢循环、自我修复、产生子代细胞,并且活化增殖毛发生长早期的细胞。毛囊黑素干细胞 (follicle melanocyte stem cells,FMSC)是MSCs中的一种。有报道鼠毛囊外隆突区检测出MSCs[1]。鼠的胚胎研究显示,FMSC存在于毛囊永久性区域的下部毛囊隆突区,具有MSCs的特征,受刺激后可以分化成为成熟的黑色素细胞[2]。因此,笔者设计此实验初步定位人胎儿的FMC,观察HMB45,NKI/beteb在人类胎儿毛囊中的表达情况。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 标本来源:引产胎儿的头皮(胎龄7月,畸形引产),取标本时,胎儿已死亡2h。
　　1.1.2主要仪器及试剂:小鼠抗人HMB-45单克隆抗体(北京中山生物技术公司);小鼠抗人NKI/beteb单克隆抗体(Abcam);DyLightTM488标记山羊抗小鼠IgG(北京中山生物技术公司)辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(北京中山生物技术公司);OLYPUS倒置显微镜;激光共聚焦显微镜(NIKON-EZ-C1SI)。
　　1.2 方法
　　1.2.1 标本处理:获取胎儿头皮,用碘伏浸洗5min后,酒精去碘伏,接着生理盐水冲洗数次,剪刀修剪组织标本,去除脂肪,筋膜等多余组织,再用生理盐水冲洗数次,最后多聚甲醛固定组织15min后,制备冰冻切片(4μm),用冷丙酮固定15min。
　　1.2.2 共聚焦显微镜观察:TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗组织切片,5min/次,需2次,5%牛血清白蛋白室温封闭15min。TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗组织片,5min/次,需2次。分别加入一抗小鼠抗人HMB-45(1:100),NKI/beteb(1:100)单克隆抗体孵育,4℃过夜。TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗组织片3次,5min/次。暗室内加免疫荧光二抗DyLightTM488标记山羊抗小鼠IgG(1:200),37℃孵育,2h。TBS溶液浸洗组织片3次,5min/次。自然晾干。90%甘油封片。DyLightTM488-TFP荧光素是在Omnichrome氩-氪离子激光器的488nm处激发,515～565nm波段处滤过发射。激光共聚焦显微镜下观察摄片。
　　1.2.3 倒置显微镜观察:PBS洗浸洗组织切片,0.3% Trito nX-100孵育,PBS洗,5%牛血清白蛋白封闭10min,分别加入一抗小鼠抗人HMB-45(1:100),NKI/beteb(1:100)单克隆抗体孵育2h。PBS洗,加免疫组化二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG孵育30min。PBS洗,SP反应,DAB显色,苏木素复染,乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。倒置显微镜下观察摄片。
　　
　　2结果
　　2.1 激光共聚焦显微镜:激光共聚焦显微镜观察NKI/beteb抗体免疫荧光标记显示,毛球部荧光强度高,呈簇集状,沿毛球线形分布(图1A)。在毛囊的横断面或斜切面上,荧光在毛囊周围及其附近皮脂腺结构处明显,呈线状勾勒出毛囊的切面的轮廓,在表皮基底部,荧光呈点线状分布(图1B)。在毛外根鞘中下段可以清楚的看到,均匀分布的荧光染色,放大后可见1～2个细胞聚集在一起(图1C)。HMB-45抗体免疫荧光标记显示,在毛囊的纵切面上,荧光在毛漏斗部和毛球部处明显,呈线状勾勒出毛球的切面的轮廓;荧光在表皮基底均匀分布(图1D)。在毛囊的横切面上,荧光在毛囊周围,皮脂腺周围增强(图1E)。根据外形推测这两个毛囊,为休止期毛囊。其荧光最显著处,推测是毛球底部、毛乳头区(图1F)。但是,荧光在毛囊外根鞘出没有分布,这表明外根鞘细胞HMB-45表达阴性。
　　综合以上观察,在胎儿头皮中NKI/beteb阳性细胞大多分布于毛囊毛球部,毛漏斗部,皮脂腺,表皮基底部和毛囊外根鞘中下段。HMB-45阳性的细胞大部分位于毛囊毛囊漏斗部,毛球部,皮脂腺和表皮基底部,而毛囊外根鞘上的细胞表达HMB-45呈阴性。
　　2.2 倒置显微镜观察:倒置显微镜观察NKI/beteb染色,显示毛囊的斜切面,NKI/beteb染色阳性的棕色颗粒,分布在毛球部及外根鞘中下部部位(图2A)。在毛漏斗部及其周围的皮脂腺也有阳性细胞分布(图2B),进一步放大倍数可以看到,在毛球部聚集阳性细胞。这些阳性细胞2～3个聚集,体积比较小,无明显树突,形态与其周边的细胞相类似,但是其周边细胞中无阳性颗粒 (图2C)。HMB-45染色,显示阳性细胞位于毛母质(图2D),毛囊毛球部有阳性细胞分布,呈棕褐色颗粒,簇集状分布(图2E);皮肤基底部也散在分布阳性细胞,呈点状线性分布(图2F)。
　　综合以上观察,NKI/beteb抗体染色显示,阳性细胞分布在毛球,毛漏斗部及外根鞘,在外根鞘的中下段,有少数成群分布的被染成褐色的细胞,胞体较扁圆,无明显树突。HMB-45抗体染色显示,在外毛根鞘上细胞均呈阴性,而在毛母质区和毛球部为阳性。
　　
　　3讨论
　　人黑素细胞起源于神经嵴,在胚胎发育早期(2～5周)逐步向毛囊、表皮等处移行。在其移行过程中,有少数成黑素细胞在中途停滞或者开始转化成为无黑素合成活性并且未活化的黑素细胞(Amelanotic Melanocyte, AMMC)。早在1954年,Chase提出在毛囊上外跟鞘部存在一群细胞,它们不仅能够再生毛囊,还可以再生皮脂腺和滤泡间上皮。在每个毛囊周期期间这些细胞导致毛囊皮脂腺单位的重塑。现在已知这种重塑由存在于毛囊内的干细胞系控制。在人类毛囊中已经鉴定出几种类型的干细胞,包括表皮干细胞、间充质样干细胞[3-4]、黑素细胞干细胞[5]和巢蛋白阳性干细胞[6-7]。已经证实这些细胞在毛囊中既存在于不同微环境,又交错在一起。鼠黑素母细胞的分化增殖条件已被广泛研究,研究者们认为毛囊和皮肤的黑素细胞干细胞来源于这些细胞[8-9]。在毛囊外毛根鞘处可以分离和培养出AMMC[10]。在国内外把从毛囊中分离和培养出的黑素细胞称黑素母细胞[11]。尽管在鼠和人胚胎皮肤中确定并容易鉴定隆突,但是在成人毛囊中隆突并没有形态学外观[12]。所以人们日益对隆突干细胞特异性标志物感兴趣。
　　AMCC中的黑素小体发育不成熟,但在基因调控或外界刺激下,激活,增殖,且具有黑素化能力。NKI/beteb和HMB-45单克隆抗体都识别黑素小体上的膜分子蛋白-gp100,前者识别前黑素小体和成熟的黑素小体上的gp100,但后者只识别成熟的黑素小体上的gp100。这可能是由于这两种抗体识别同一个分子不同的表位。所以,HMB-45单克隆抗体都不能单独标记出这类黑素细胞。然而可以借助NKI/beteb单克隆抗体等抗体的联合来识别AMMC。
　　本次试验发现,NKI/beteb阳性细胞是位于外毛根鞘中下段,毛球部,毛漏斗部及其皮脂腺。但在HMB-45染色中,阳性细胞在毛母质,毛球部。外根鞘中没有HMB-45阳性细胞。因此笔者推测外毛根NKI/beteb阳性染色的细胞就是AMMC,它们仅表达前黑素小体的相关抗原,却不表达黑素小体的相关抗原以及黑素合成的相关酶蛋白。这些研究也表明,毛球部也有AMMC,其功能具有不成熟性。
　　黑素母细胞的研究,对于色素性疾病的防治有重要意义[13-14]。激活毛囊外黑素母细胞,促进其移行到表皮,对白癜风等色素减退性疾病的治疗起着重要的作用;研究黑素细胞转移相关因子,找到其中的关键因素,可以进一步理解黑素瘤的形成和转移。本次实验对进一步研究分离黑素母细胞,促进其增值分化,奠定一定的基础。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2010-04-20 [修回日期]2010-06-24
　　编辑/张惠娟