《发酵染菌应急预案》

发酵染菌应急预案 一、 染菌确认与报告 1、       染菌确认 a、连续3个样品镜检发现有杂菌且有增多趋势，无菌试验样品发现染菌，发酵各项理化指标有明显异常变化的，可判断为染菌；

b、怀疑染菌的罐，在不影响正常生产安排的前提下，继续培养，且取无菌样进行肉汤培养，同时做平皿划线分离，直到结论明确。

  2、 染菌报告 发酵车间员工发现染菌和疑似染菌的情况，必须立即报告车间主任，发酵车间主任了解情况后做初步判断，并通知菌种车间、中试车间及生产部经理，共同判断、分析。

发酵车间应首先发现本车间的发酵染菌情况，否则车间主任和工艺员应负有责任。

二、染菌现象描述 对染菌罐样品，应做以下描述：
1、 发现染菌的时间 确定从哪一个样品开始发现染菌（或怀疑染菌），之后的样品有没有同样的现象、杂菌量有无变化。

  2、 镜检描述 菌体形态（结合美兰和品红两种染色方法染色同时判断，比较所染杂菌与生产菌变化情况的形态），染色深浅，大小，数量（与生产菌比较）。

注:镜检应观察5个视野以上，Bt、杆菌肽发酵液样品应稀释10倍再涂片镜检。

  3、 理化指标    pH变化情况，菌浓变化情况，对效价的影响，发酵液气味 附样品描述记录：
                                染菌分析记录表 生产批号：                            罐号 取样时间 镜检情况 备注                         分析讨论情况：
      结论：
                                                             签名：               年   月   日 处理措施：
                                                             签名：               年   月   日 预防措施：
                                                             签名：               年   月   日 三、染菌检查与分析 1、 思想认知 发生染菌情况后，各车间负责人应实事求是，主动查找车间范围内的问题，杜绝本位主义，做到通力协作、齐心分析、查阅书籍、逻辑推理、认真检查、严格试验、广泛讨论、不辞辛苦。

  2、染菌原因初步分析 a、种子罐早中期染菌：母瓶种子带菌。

                     空气过滤器“漏菌”。

                     灭菌不到位。

                     接种操作不严密。

                     其他意外事件（如停电、阀门坏等）。

b、发酵罐早中期染菌：种子罐带菌。

                     空气过滤器“漏菌”。

                     灭菌不到位。

                     移种操作不严密。

                     补料操作或补料液有问题。

                     其他意外事件（如停电、阀门坏、设备漏等）。

3、 杂菌分离、培养     对已确定染菌和隐性染菌的罐批，应取染菌发酵液（或疑似染菌的发酵液）无菌样, 在平皿上标明样品的品名、来源与取样时间，然后在超净工作台上进行平皿划线分离,在37℃恒温箱内培养, 每天在灯光下检查有无杂菌生长。观察杂菌菌落特征，并涂片镜检，确定所染杂菌的类型。

  4、 杂菌耐热性实验 取染菌发酵液（或疑似染菌的发酵液）4瓶，标明品名、来源与取样时间取1瓶作对照，另3瓶分别在110℃、115℃、121℃灭菌30分钟。然后将四个样品定量接入肉汤培养基，在37℃恒温箱内培养,观察肉汤的培养情况。

  5、 设备检查     a、空气净化系统     打开预、精过滤器壳体，拆检过滤器橡皮垫圈，检查是否有老化、断裂而失去密封效能；
拆检预、精过滤器滤芯，检查是否有老化、断裂，滤芯外观孔目是否有堵塞、变形现象。

拆检结束，安装壳体并对过滤器法兰接口、排污阀、空气取样阀、压力表丝口、空气阀、焊接缝等进行试压、试漏，密封性能需达到无泄漏标准；
且预滤、精滤的压差应在≤0.05MPa的范围之内。    b、罐体、阀门试漏 准备好洗衣粉水、刷子，盖好罐盖，关闭排气阀，开启进气阀，给发酵罐加压，当罐压≥0.10MPa时，即可对该罐进行试漏。

试压试漏方法：试外漏时，把洗衣粉水喷涂在阀门阀盖、法兰或丝口上，及阀门整体外部和管路焊缝等可能泄漏的地方。试内漏时，关闭待试阀门，把洗衣粉水喷涂在阀门排气管孔上，经涂抹部分如有气泡产生，可以确定有漏点，应及时复检。

c、蛇管、夹层试漏 放尽罐内积水,开空气吹干或用布擦干罐内壁.将蛇管、夹套内充满水，注意观察是否有水渗出。也可将夹套内的水放尽，将压缩空气通入蛇管、夹套内，用洗衣粉水喷涂，注意观察是否有气泡冒出。

  6、 无菌试验 发现染菌的设备处理后应做无菌试验：
     a、培养基配方    原料名称 配比（％）
酵母粉 0.5 玉米浆 3 葡萄糖 1 氯化钠 0.5 消前pH6.5～7.0。

b、培养条件 37±2℃，48hr以上 注：消后应取样涂片镜检，作为镜检对照。

  7、 菌种车间接种后，将肉汤培养基15～20ml倒入接种瓶中，与残留液混合， 37℃恒温箱内培养48hr以上。

  8、 环境检查与清洁 a、超净工作台沉降菌检测 b、菌种、发酵车间环境清洁     三、 染菌处理 1、 染菌料液的处理      参照《发酵异常现象的处理SOP》
  2、 设备处理      在染菌料液处理完后，在再次投料之前, 先彻底清洗染菌发酵罐罐体、附件, 同时进行严密程度检查,以防渗漏，然后用甲醛等化学物质熏蒸处理,再用蒸汽灭菌〈包括各种附属设备〉。

  四、 预防措施与基础研究 1、 空气系统     定时放水，保持干燥。

定期拆检,在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻或烧灼,还要防止发酵液倒流入空气过滤器内。

2、       设备检修 发酵罐及其附属设备应做到无“渗漏”,无“死角”。定期试漏。

无菌操作室和菌种培养间定期消毒,以保持无菌状态。

定期用甲醛熏消。

3、       操作要求 发酵罐放罐之后,对罐体和附属设备进行全面清洗和检查,清除罐内的残渣,除尽罐壁上的污垢,清除罐内附件处的堆积物。

    培养基配制时要防止物料结块或带入异物,配料罐和输送料液系统要定时清洗消毒。

    对进入无菌室的全部物料、器械实行灭菌。

  4、      人员培训 a、对新员工培训，应采取学徒制，指定有资质的技术工当师傅，并对新员工的学习进程做好跟踪考核，保证其操作水平。

b、对员工进行划线分离、无菌取样等基本操作培训，保证操作的准确性、一致性。

c、定期开展岗位操作竞赛，对员工的操作质量进行考核，提高员工进行日常操作培训的积极性。

5、 整理出公司各发酵产品正常生产时各周期的典型镜检照片各一套，收集典型的染菌料液镜检照片和各种杂菌的镜检照片。

  6、 研究不同的杂菌单独培养时的情况，如形态，生长速度，培养基成分、培养温度、通气、计数式接种量等因素的影响。

  7、 研究不同的杂菌和生产菌种混合培养时的情况，重点是观察在不同的混合时间混合时，杂菌和生产菌种的表现情况，如形态，生长速度，培养基成分、培养温度、通气、计数式接种量等因素的影响。

  五、记录与存档     发生染菌情况后所做的现象描述、各项检查、分析讨论、纠正预防措施、日常培训、基础研究等工作均应做好记录，并将记录送交工艺质量可归档保存。

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