口蹄疫O型、A型和Asia I型病毒RT—PCR分型方法建立

　 口蹄疫O型、A型和Asia I型病毒RT—PCR分型方法的建立

　摘要 该研究旨在建立一种快速、灵敏及准确的口蹄疫病毒（FMDV）鉴定与分型的RT-PCR检测技术平台，为临床中有效准确地检测口蹄疫病毒提供有力的支持。根据NCBI中公布的FMDV序列（GenBank：JF749861.1），设计FMDV通用检测引物FP1/FP2；根据NCBI中公布的FMDV O型、A型和Asia I型序列，经过序列分析比对后，分别设计FMDV分型引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2。提取FMDV RNA后，利用随机引物扩增得到FMDV全cDNA，利用设计的引物进行PCR扩增及PCR反应条件的优化。结果表明：该研究建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性、敏感性和可重复性。成功建立了FMDV O型、A型和Asia I型检测及分型方法，为口蹄疫疾病的临床检测、流行病学相关调查及针对性的疫苗的制备奠定基础

　　关键词 口蹄疫；RT-PCR；O型；A型；Asia I型

　　中图分类号 S855.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）14-0249-02

　　口蹄疫（foot-and-fouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄类动物共患的接触性传染病，具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，临床特征主要是患病动物口腔黏膜、乳房和蹄部出现水泡等，位列世界动物卫生组织（OIE）A类家畜传染病之首，一旦暴发，只能通过屠宰和集体焚毁的方式进行处理，给世界范围畜牧业造成严重危害[1-2]。

　　FMDV属微RNA病毒科口蹄疫病毒属，是一种正链单股RNA病毒，根据血清学反应的抗原关系，FMDV可分为O、A、C、Asia I、南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 7个不同的血清型和60多个亚型，且各型之间几乎无交叉免疫反应，我国FMDV主要是O、A及Asia I型[3-4]。目前，FMDV的检测主要有病毒分离、间接ELISA和RT-PCR 3种方法。病毒分离虽然有较高的灵敏度，但对病料的要求较高，另外还有成本高、周期长、操作相对复杂等缺点，在临床检测中应用范围较窄[5-6]。间接ELISA对口蹄疫病毒的检测虽然操作相对简单，也具有很好的灵敏度，但对数量较多的病料进行检测时会出现操作繁琐，用时较长的不足，另外获得间接ELISA检测需要的大量标准抗原的也存在一定的难度[7]。RT-PCR是目前应用较为广泛的常规检测方法，具有操作简单快速、成本低、灵敏度高等特点，引物特异性的高低直接影响着RT-PCR检测的效果[8]。因此，该研究针对NCBI中公布的FMDV O、A及Asia I型序列，经过序列比对后，设计得到特异性更好的检测引物，摸索PCR反应条件及重复性，目的在于建立一种快速、灵敏及准确的口蹄疫病毒（FMDV）鉴定与分型的RT-PCR检测技术平台，为临床中有效准确地检测口蹄疫病毒提供有力的支持。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　RNA提取及反转录试剂盒购自Trans公司，DNA Marker、PCR相关试剂均为TAKARA公司产品，引物设计及序列测序等均在华大基因完成。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 引物设计。根据NCBI中公布的FMDV序列（GenBank：JF749861.1），参照Hoffma et al[9]设计FMDV通用检测引物FP1/FP2，扩增目的条带为450 bp；根据NCBI中公布的FMDV O型、A型和Asia I型序列，分别设计FMDV分型引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2，扩增片段大小分别为255、347、473 bp。引物序列如表1所示。

　　1.2.2 FMDV cDNA的获得与检测。参照Trans公司的TRIzol试剂盒操作步骤提取病毒RNA，操作过程中尽量避免RNA酶的污染。病毒cDNA的合成按照Trans 反转录试剂盒步骤进行，以RT-PCR获得的病毒cDNA为模板，利用设计的FMDV通用检测引物FP1/FP2进行PCR检测，判断是否得到可用于后续试验的cDNA片段。

　　1.2.3 FMDV分型PCR方法的建立及特异性检测。以检测正确的各型cDNA为模板，利用设计好的引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2，分别进行PCR扩增试验，PCR程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55～65 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 完全延伸10 min，探索PCR反应条件。将最终得到的各型PCR检测产物送华大基因测序，验证PCR结果的特异性。

　　2 结果与分析

　　2.1 FMDV cDNA的获得与检测

　　将反转录得到的cDNA利用通用引物进行检测，检测结果如图1所示，获得与预期大小一致的条带，说明成功得到可以用于后续试验的cDNA模板。

　　2.2 FMDV分型PCR方法的建立及特异性检测

　　用引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2，PCR分别扩增O、A和AsiaⅠ型FMDV及各阴性对照cDNA，结果如图2、3、4所示。可以看出，设计的引物均有很好的特异性，O、A和AsiaⅠ三型之间无交叉，且阴性对照均没有扩增出条带，由此表明建立FMDV分型PCR检测方法有很好的特异性。

　　将PCR产物送华大基因测序，测序结果在NCBI数据库中对比显示，各型PCR结果与目前公布的FMDV各型序列具有很高的同源性（≥98%），且各型之间无交叉，特异性较好。

　　3 讨论

　　口蹄疫最易感染的动物是牛、羊、猪等偶蹄动物，具有传播速度快、传染性强、发病率高等特点，在新流行地区该病发病率几乎达到100%。虽然感染口蹄疫的动物死亡率较低，但是患病动物生产力明显下降，同时与其相关的动物制品也限制上市，造成的经济损失难以估量[10-11]。因此，快速有效的诊断技术在预防和治疗口蹄疫方面是不可或缺的，也是有效控制和消灭该病的前提，而进一步的口蹄疫分型鉴定，对于制订口蹄疫的有效防治措施必不可少。

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　　近年来，口蹄疫的检测技术取得了很大的进步，其中

　　PCR技术以其特异性强、灵敏度高、可同时检测多种样品、需要样品量少、操作简单等特点，在临床检测中应用越来越广。另外，PCR不但可以检测有活毒的样品，也能检测经过灭活的样品，很大程度上增加了临床检测的安全性[12-14]。该研究中采用的RT-PCR检测技术，很好地利用了PCR的优点，设计FMDV通用型检测引物及O型、A型和AsiaⅠ型特异性分型引物，反转录获得FMDV各型cDNA序列后，分别用各型特异分型引物进行PCR检测，均得到与预期大小一致的条带。同时与现代测序技术相结合，将获得的PCR产物送华大基因测序后发现，所扩增的各型PCR条带均有很好的特异性，且各型之间无交叉，说明该研究中建立的FMDV分型RT-PCR检测引物及方法具有很好的特异性，可以用于临床检测。

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