骨组织工程常用间充质干细胞的研究进展|干细胞与组织工程

　　胚胎干细胞(ES)与间充质干细胞(MSC)一直是组织工程最为常用的种子细胞。但目前由于ES的分离获取存在医学伦理学的争议,研究受到了一定的限制。而MSC,是一类具有多向分化潜能的干细胞,可来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐血、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等各种组织中,在特定条件下可向骨、软骨、心肌、脂肪、血管内皮等间叶组织细胞转化。具有来源广泛、相对容易获取、扩增表型稳定,同时避免了医学伦理学争议等优点而越来越受到研究者们的青睐。本文就骨组织工程常用MSC的生物学特性及基础与临床应用研究进展作简要综述。
　　
　　1生物学特性分析与比较
　　自1995年Grane提出骨组织工程这一概念以来,经过十几年的研究,骨组织工程在种子细胞、支架材料以及细胞-支架材料复合体等方面的研究取得了很大进展,为临床骨缺损修复重建打下了良好的基础。其中种子细胞的研究与应用主要集中在以下几种间充质干细胞:骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪干细胞、肌源性干细胞等。
　　MSC是一类具有多向分化潜能的干细胞,可来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐血、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等各种组织中。在特定条件下可向骨、软骨、心肌、脂肪、血管内皮等间叶组织细胞转化。来源不同的MSCs,虽在生物学特性方面均表现干细胞特性,但相互之间仍有一定差异。目前对于MSCs的生物学特性研究主要集中在以下几个方面:
　　1.1分离培养
　　1.1.1骨髓间充质干细胞(BMSCs):具有来源广泛、相对容易获取、扩增表型稳定,无医学伦理学争议及过大的骨异常增殖趋势等优点,被公认为是骨组织工程最为常用的种子细胞。目前分离BMSCs的常用方法有5种:即全骨髓法、密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪法及免疫磁珠法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液弃去不贴壁细胞,从而达到纯化细胞的目的;密度梯度离心法是根据BMSCs与其他细胞的密度不同而采用percoll分离液将其分离出来;贴壁筛选法则是根据BMSCs具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离;流式细胞仪分选法则是根据BMSC体积小、相对缺少颗粒的特性对它进行分选;而免疫磁珠法则根据细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选,用抗体包被磁珠,获得相对纯化的细胞。其中由于经过流式或磁珠分选后的干细胞会出现增殖缓慢等一些问题,加之耗费较大和技术的难度,两者应用并不广泛。目前最为常用分离BMSCs的方法主要是全骨髓法和密度梯度离心法,由于单独应用时存在获取细胞纯度不够及数量较少等缺陷,近年有人尝试用密度梯度离心结合贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞,效果比较理想[1]。
　　BMSCs一般原代培养接种3～4h后开始贴壁,24h大量贴壁;2～3天见部分集落形成,大多数细胞有胞浆突起;7～10天集落迅速增多,以梭形细胞为主,胞浆丰富、核大、核染色质细、核仁明显,细胞呈平行排列或漩涡状生长;14天左右融合达80%～90%,可进行传代。传代细胞呈均匀分布生长,细胞以梭形为主。BMSC的生长潜伏适应期为1～2天,3天后进入对数生长期,6～7天后进入生长平台期。BMSC倍增时间为30～50h,细胞每传一代,细胞数约增长2倍。不同物种的BMSCs特性不尽相同,不同培养基、血清浓度、细胞接种密度、换液时间、酶消化时间、培养基pH值都会影响其生长[2]。
　　1.1.2脐血间充质干细胞(UC-MSCs):脐带血是脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞(HSCs)和MSCs。与骨髓相比,脐带血有更充足的来源;脐血的免疫原性较弱,能耐受更大程度上的HLA配型不符;移植物抗宿主病(GVHB)发生率较低;其间充质干细胞更为原始,扩增能力更强等优点,故脐血干细胞可作为一种新的替代细胞来源,用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗,它的作用也越来越受到重视[3]。
　　目前用于UC-MSCs分离的方法同BMSCs基本相同,但UC-MSCs的分离培养和筛选与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、筛选过程中操作技术等多种因素有关,也无统一标准。不同培养基、不同批次的血清、不同的pH值、不同接植密度都会影响细胞的生长。一般原代培养的脐带血间充质干细胞多在培养24～48h后贴壁,1周左右成梭形,并成克隆性生长,4～5周可达80%以上的融合。原代培养的干细胞中可见多核,形态扁平的破骨样细胞混杂,一般传代至第3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形的间充质干细胞[3]。
　　1.1.3脂肪间充质干细胞(ADMSCs):是指从脂肪组织抽吸物中获得的一种成纤维细胞形态的细胞群,具有取材容易,获得率高, 自我更新能力与多向分化潜能类似BMSCs等优势。原代培养细胞呈平行排列,漩涡样生长,细胞多为梭形、多角形等,胞浆和核仁丰富。传代培养中,经过多次传代(10～20 代),细胞的增殖速度无明显减慢,衰老和死亡细胞所占比例也很少。这表明脂肪组织蕴含丰富的干细胞,且细胞体外扩增能力很强,易于传代培养[4]。由于ADMSCs来源广泛、取材容易且分离提取方法相对简单,形态及功能均类似BMSCs,近年来日益受到研究者的重视。
　　目前对于ADMSCs的提取主要采用的是酶消化法,即在无菌条件下取脂肪组织,经I型胶原酶消化后离心收集沉淀再经200目细胞筛过滤获取目的细胞。同其他MSCs一样,不同组织来源的脂肪、不同实验室不同操作人员的操作技术、不同培养基、不同批次的血清、不同接种密度等也都会影响ADMSCs的生长。
　　1.1.4肌源性干细胞(MDSCs):骨骼肌中含有丰富的细胞成分,从原始的干细胞到终末分化的成熟细胞。近年来在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。研究表明,它是和被证实的骨骼肌中含有的能够自我更新并向肌、骨以及脂肪组织细胞等分化的肌卫星细胞是完全不同的一类细胞群,可能是一群未向任何方向分化的原始干细胞。与BMSCs相比,其具有来源相当丰富、易于分离、易于诱导成骨等优点,使之得到越来越多研究者的重视,并在骨组织工程研究中被广泛应用。目前对于MDSCs的分离,基本上同ADMSCs,同样是在无菌条件下取特定组织块,然后经酶消化后离心、过滤。具体操作流程与细节,由于实验室条件、操作者水平等差异,而略有差异。而纯化技术主要有三种:冷冻法、Hoechst/FACS法以及Pre-plate法。其中冷冻法与Hoechst/FACS法并不常用,而Pre-plate是利用细胞贴壁速度慢的特点,经反复贴壁培养而除去非干细胞以达到分离纯化MDSCs的目的,因此有学者称之为差速贴壁法。该方法在近年MDSCs的分离纯化上逐渐得到认可并被广泛使用[5]。原代培养MDSCs的较其他细胞贴壁较慢,一般在分离后5～6h贴壁,其体积较小,呈球形,折光性强,48h后完全贴壁,并开始增生,细胞逐渐变成椭圆形或纺锤形,进一步相互融合有规律地逐渐平行排列,7～10天时,细胞90%融合,常规消化传代同其他干细胞[6]。
　　1.2细胞分化功能:MSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定的诱导实验条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞等。由于来源不同,分化表型亦有一定差异。而骨组织工程常用种子干细胞在分化功能上有着统一的共性―极易诱导分化为成骨细胞。应用常规诱导培养剂:VitaminC、Beta-甘油磷酸钠以及地塞米松,均可将它们成功诱导分化为成骨细胞。另外,随着近年来对于细胞因子研究的深入,越来越多的细胞因子亦被发现具有明显的促进干细胞成骨的特性,如骨形态蛋白BMP、碱性成纤维细胞因子bFGF、转移生长因子-Beta等[7-8]。
　　1.3 间充质干细胞的免疫表型及鉴定:目前,认为MSCs是一个异质细胞群, 因此至今仍未发现其特异性抗原表型,且不同来源的间充质干细胞免疫表型也有不同。BMSCs表达的抗原标记主要有: SH2、SH3、CD29 、CD44、CD71、CD9、CD105、CDl06、CDl20a、CDl24、HLA-I等,而不表达其他造血细胞系的表面标记CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD117 等细胞表面抗原[9-10]。这些抗原均具有间质细胞特征,无特异性。而UCB-MSC表达的主要分子包括:①粘附分子,CD54、CD51、CD44、CD13等;②整合素家族成员,CD49b、CD49e、CD29等;③其他,CD90(Thy1)、SH2(CD105)、HLA-ABC、ASMA、SH3(CD166,ALCAM)、SH4(CD73)等。但不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD 38、CD133、CD135(Flt-3)、CD117(c-kit)、Glycophorin A等,也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物II类分子如HLA-DR抗原等[11]。ADMSCs在免疫表型方面则较以上两者又有一定差异。苏海鹏等[12]总结了体外培养的ADMSCs表达的蛋白:①粘附分子:可表达CD9、CD29、CD49d、CD54、CD102、CD106、CD166,但不表达CD56、CD50、CD11b、CD18、CD62;②分子受体:可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体;③细胞外基质蛋白和糖蛋白:ADAS细胞能生成I和II型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、Thy-1 (CD90) 和MUC-18 (CD146);④肌蛋白:能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白;⑤造血细胞标记:不表达造血细胞标志物CD14、CD31 或CD45;⑥补体调节蛋白: 确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白;⑦组织相容性抗原: 表达类组织相容性蛋白HLA-ABC,而不表达类蛋白HLA-DR。目前,MDSCs由于取材、分离提纯方法及培养环境的不同,获得的MDSCs表面标志物也不尽相同。但Mastrogiacomo等[13]对比了MDSCs和BMSCs表面标志物,结果显示两者有十分相似的表达,证明两者是性质相似的MSCs,其特点为:①干细胞标志Sca-1(+)、CD34 (+/-);②早期成肌系标志Desmin、Bcl-2、C-met表达不一致;③造血干细胞标志c-kit(-)、CD45(-),其他CD10、CD13、CD56等标志物表达不一。
　　
　　2在骨组织工程中的应用
　　鉴于上述间充质干细胞的生物学特性及各自优势,它们在骨组织工程研究中的应用越来越广泛,并在基础实验与临床应用研究两个环节都取得了可喜的成果。目前,伴随基因工程的发展,它们在骨组织工程研究中的作用得到了更大的体现和发挥。
　　2.1 基础研究:由于大块骨缺损修复面临的血管化难题目前还没能得到很好解决,利用骨组织工程技术仍无法满足临床上形式各异的骨缺损修复需要,因而大量的基础研究正在为解决血管化难题,尽快实现由基础研究向临床过渡而努力。Jian Zhou等[14]将兔的BMSCs与源于MSC的内皮细胞联合培养于多孔beta-磷酸三钙支架材料上构建血管化组织工程骨用以修复兔的大尺寸骨缺损。结果显示出良好的成骨和血管化效果,不仅证明该方法修复动物大块骨缺损行之有效,也是临床修复大块骨缺损很有潜力的方案。而Lei Cui等[15]利用脂肪来源的间充质干细胞复合珊瑚支架,成功修复了犬临界尺寸(20mm×20mm)颅盖骨的缺损。实验在12周与24周时分别对植入犬颅盖骨缺损处的细胞-珊瑚支架复合材料组和单纯植入珊瑚材料组做三位CT及放射图谱分析等检测,结果显示实验组较对照组骨修复体积提高了3倍多,前者基本能够达到良好修复颅盖骨缺损的要求。另外,经Rebekka等[16]研究发现UC-MSCs同BMSCs不仅在生物学特性方面有很多相似特性,与三维胶原支架复合培养实验中,经组织学、免疫组织化学、免疫印迹分析和实时定量RT-PCR等检测分析表明,UC-MSCs与BMSCs均展现了有效骨折愈合的所有特性。最后,虽然目前MDSCs在骨组织工程中的应用不如其他细胞广泛,但近年来呈现明显增长态势。Kyung等[17]对大鼠MDSCs复合壳聚糖支架于体内成骨向分化实验研究表明,凝胶壳聚糖支架是MDSCs粘附和增殖的理想基板,此外,细胞联合壳聚糖支架实验组植入体内后不光免疫反应较单纯植入支架组低很多以外,骨形成也被证实只存在于带MDSCs与骨诱导因子的凝胶壳聚糖支架材料中。
　　2.2 临床应用:尽管目前骨组织工程技术还没有广泛应用于临床,但近年来国内外报道的骨缺损修复临床成功病例已越来越多。其中骨髓间充质干细胞应用最早且最为常见,脂肪间充质干细胞近年来也有报道,而脐血间充质干细胞及肌源性干细胞则鲜有报道,目前还主要集中在细胞自身研究及动物基础研究阶段。Marcacci等[18]将人的BMSCs复合多孔羟基磷灰石陶瓷生物材料构建与临床患者骨缺损尺寸大小相当的组织工程骨,然后利用外科手段植入临床骨缺损处。手术早期患者无大的并发症及其他症状,手术部位亦无明显疼痛、肿胀及感染等现象,移植物在植入5～7个月时与宿主骨完全融合,跟踪调查6～7年骨结合良好且未发生迟发型骨折。最终结果证实利用骨组织工程技术能够成功修复大尺寸临床长骨骨缺损。Lendeckel等[19]则利用纤维蛋白凝胶包裹自体ADMSCs,然后应用两块可吸收板将其固定于患者颅骨缺损处,术后疗程顺利且3个月后经CT扫描观察到新骨几乎形成完整颅骨。
　　
　　3 小结
　　间充质干细胞以其特有的优势成为组织工程理想的种子细胞,并在骨组织工程基础与应用研究中被广泛应用。但骨组织工程要想真正实现血管化进而达到临床化,对于间充质干细胞的研究仍有很长的一段路要走。MSC来源广泛但表型却有很大不同,是否是同种细胞,性质又有何特异性差别,目前尚不清楚;不同来源的MSC分化功能也有差异,如何准确控制其向某一特定方向转化也无统一标准;另外,MSC的分离提纯方法虽然很多,但同时也表明目前仍没有一种最为理想的方法来获取大量纯化的MSC。种种问题都需要我们在研究中不断地去发现、分析及解决。只有这样,MSC的价值才能在骨组织工程研究中得到最大程度的体现,真正造福于人类。
　　
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　　[收稿日期]2010-01-03 [修回日期]2010-03-15
　　编辑/李阳利