怎么抑制酪氨酸酶 鱼胶原肽抑制酪氨酸酶活性能力的比较研究

　　[摘要]目的：比较研究鱼胶原肽与市场上同类产品抑制酪氨酸酶活性的能力。方法：利用受试物抑制酪氨酸酶催化底物（L－多巴）发生反应从而减少黑色素生成的原理，以曲酸作标准对照，用分光光度计测定反应液在475nm的吸光值，通过吸光值比较各受试物对酪氨酸酶活性的抑制能力。结果：与曲酸标准对照相比，20g/L质量浓度的鱼胶原肽溶液的酪氨酸酶抑制率可以达到30%以上，远强于市场上的同类产品，其抑制率随浓度上升非线性增强。结论：鱼胶原肽作为无毒副作用的纯天然美白化妆品原料，拥有广阔的发展前景。
　　[关键词]酪氨酸酶；胶原肽；曲酸
　　[中途分类号]751,R622 [文献标识码][文章编号]1008-6455(2008)10-1512-03
　　
　　Contrastive study on activity of tyrosinase inhibition of fish collagen peptide
　　CHEN Long,CHEN Dong-liang,YANG Guo-yan,WANG A-jing,TANG Liang-yan
　　（Wuhan Application Research Center for Peptide Substance of China Polypeptide Group,Wuhan430023，Hubei,China）
　　
　　Abstract： ObjectiveCompare with and study on tyrosinase inhibition activity of fish collagen peptide and other similar products from market.MethodsBased on the tester"s inhibition to catalyzing reaction of tyrosinase to its substrate（L-dopa）in order to reduce melanoma, and use kojic acid as standard control, compare tyrosinase inhibition activity of testers with absorbency of 475nm.ResultsCompare with standard control，the inhibition Rate of fish collagen peptide (20g/L) can beyond 30%,much more higher than any other products from market. And it"s inhibition rate rises with it"s concentration non-linearly.Conclusion As an innocuity，non side-effect and pure natural material of whitening cosmetic products，fish collagen peptide has broad prospects for development.
　　Key words：tyrosinase；collagen peptide；kojic acid
　　
　　人类皮肤的颜色与皮肤中存在的色素的种类和数量有关，黑色素对皮肤颜色影响最大。黑色素在表皮基底部的黑色素细胞中形成。其过程为黑色素细胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴、多巴醌，最终形成黑色素。酪氨酸酶是黑色素生成的关键酶[1]。
　　目前的皮肤美白剂就是通过抑制酪氨酸酶活性或者阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径来减少黑色素的生成，从而达到美白皮肤的效果[2]。有文献报道[3-4]，存在于蜂蜜中的一种分子质量约为600Da的多肽具有抑制酪氨酸酶活性的作用；从文蛤中分离到分子质量为3 147Da的多肽对酪氨酸酶也有很强的抑制作用；Goetghebeur& Kermasha[5]从A．niger中提取到一种金属硫蛋白，也可抑制酪氨酸酶的活性，该蛋白选择性地与重金属如Zn2+，Cu2+，Cd2+或Hg2+等结合。以上3种物质主要是通过与酪氨酸酶结合形成稳定复合物来抑制酪氨酸酶的催化活性。
　　胶原的最小单元是胶原三肽（Collagen tripeptide）简称CTP。其结构可以表示为（Gly-X-Y），是一种在N端带有甘氨酸的高纯度的胶原三肽。在应用于皮肤表面时，呈现出优异的保湿效果[6]。微量射线自动照相法研究表明，CTP的平均分子质量约为280Da。
　　长期以来胶原主要是从牛和猪等动物组织中提取的。可近年来疯牛病和口蹄疫的发生使人们开始考虑使用牛、猪胶原的替代品[7]。研究表明[8]，鱼胶原肽具有安全性高、细胞粘结性好、透明、无臭和无刺激等特点，可作为化妆品的新原料。
　　用于实验的鱼胶原肽，通过高压液相色谱（HPLC）分析，其质量分数90%以上为分子质量小于1 000Da的小分子多肽，其中类似胶原三肽（Gly-X-Y）的小分子肽（分子质量280Da左右）的质量分数在50%左右，而市场上同类产品的分子质量多在2 000～3 000Da。由于鱼胶原肽分子量很小，因而能更有效地渗入角质层、真皮层，抑制酪氨酸酶活性。现通过建立在体外的酪氨酸酶活性抑制强度的检测方法来评价鱼胶原肽和市场上同类产品对酪氨酸酶的抑制作用。
　　
　　1实验部分
　　1.1受试物
　　1.1.1鱼胶原肽：采用鱼类产品加工后的下角料（如鱼鳞、鱼皮）经煮沸变性后，加入相应蛋白酶恒温水解，再经一系列后处理制备而成，其蛋白质含量≥90%，水分≤5.0%，灰分≤2.0%，其分子质量在1 000Da以下的组分质量分数为92%，其中类似胶原三肽（Gly-X-Y）的小分子肽（分子质量280Da左右）的质量分数为49.9%，其分子质量明显小于现在市场上大多数胶原肽产品所宣传的3 000Da[6]，且各项指标均符合水解胶原蛋白国标QB 2732-2005的要求。
　　1.1.2其他样品：市场上的同类型胶原产品，共计7种，计为样品1～7。
　　1.2 试剂与仪器：酪氨酸酶(25 000IU),Sigma公司生产：L-多巴溶液,5g/L[1]（上海瀚鸿化工科技有限公司）；曲酸,20g/L[1],（北京贝丽莱斯生物化学有限公司）；磷酸二氢钾（AR,河南焦作市化工三厂）；氢氧化钠（AR,汕头市西陇化工厂）。HH・W21・600型恒温水浴锅,武汉市琴台医疗器械厂；722型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；Molelement摩尔元素型超纯水机（杭州科晓化工仪器设备有限公司）。
　　
　　2实验方法
　　2.1 样品处理：用超纯水将受试物配成20g/L的溶液(酪氨酸酶是铜蛋白，溶液中不应含有铜离子)作为样品液备用。
　　2.2 实验操作：在玻璃试管中进行生化反应,各管加入所需pH6.8磷酸缓冲液(磷酸二氢钾6.8g和氢氧化钠0.944g定容至1000ml)、样品液、曲酸溶液（20g/L）和酶溶液（约7mg酪氨酸酶定容至100ml[9]）于37℃水浴中反应10min,再依次加入L-多巴溶液(5g/L),于37℃水浴中反应10min,测475nm波长的吸光值(optical density简称OD值)。实验体系设计见表1。
　　2.3功效评价表示方法
　　2.3.1抑制率计算方法：样品对酪氨酸酶活性的抑制强度以抑制率表示。参照李莉[10]介绍的较简便方法，以阳性对照结果为对照，按以下公式算出抑制率：样品抑制率＝[阳性对照吸光值－（样品管吸光值－阴性对照吸光值）]/阳性对照吸光值×100%，标准对照抑制率＝(阳性对照吸光值－标准管吸光值)/阳性对照吸光值×100%，抑制率高表明其对酶活性抑制强度高。
　　2.3.2 标准品参比：为保证实验结果的准确性，在实验室做检测时都应设有标准品对照。我们选用曲酸作为标准对照，不同批次实验时，曲酸标准对照的抑制率会有所不同，可以将标准对照的抑制率折算成100%，受试物的抑制率等比例变化后再作比较。如按照2.3.1的公式计算出受试物的抑制率为18%，标准对照的抑制率为90%，折算后的受试物抑制率为18%/90%=20%。
　　
　　3结果和分析
　　3.1受试物酪氨酸酶抑制率的检测与比较：各受试物样品液按照2.2中表1的实验操作进行实验，对实验结果（吸光值）按照2.3.1的方法计算酪氨酸酶抑制率，按照2.3.2的方法加以折算并进行统计学分析具体数据见表2。
　　
　　由表2可以看出，鱼胶原肽抑制酪氨酸酶活性的能力强于市场上的同类产品，就精密度而言各受试物的变异系数（CV）为：3.85～12.59%，均符合常规条件变异（RCV）小于15%的要求，大部分符合最佳条件变异（OCV）小于7%的要求。
　　3.2 鱼胶原肽抑制酪氨酸酶活性的量效比研究：在验证鱼胶原肽相对于市场上同类产品的优势以后，进一步对鱼胶原肽的量效比展开研究，即研究鱼胶原肽溶液的浓度与其酪氨酸酶抑制率的变化关系。
　　实验采用160g/L、80g/L、40g/L、20g/L 4种质量浓度比较鱼胶原肽的酪氨酸酶抑制力，操作步骤同2.2，对实验结果（吸光值）按照2.3.1的方法计算酪氨酸酶抑制率，按照2.3.2的方法加以折算并进行统计学分析，具体数据见表3：
　　由表3可以得出，随着鱼胶原肽溶液浓度的增加，抑制率也相应增加。就精密度而言，各浓度溶液酪氨酸酶抑制率变异系数（CV）为：1.16%～5.96%，均符合最佳条件变异（OCV）小于7%的要求，且T验证表明，不同浓度时鱼胶原肽的酪氨酸酶抑制率存在极显著差异（P＜0.01）。
　　
　　4讨论
　　通过体外试验，证实自制的鱼胶原肽在同类产品中具有较强的酪氨酸酶活性抑制能力。据人民网报道，日本政府已宣布禁止进口和生产含有曲酸的化妆品，其理由为近来科学研究证明长期接触曲酸易使人患癌。为此，国家质检总局专门下文要求各地检验检疫部门对对日出口的食品和化妆品中的曲酸加强监控。鱼胶原肽作为无毒副作用、纯天然的美白化妆品原料，有望取代曲酸等毒副作用较强的化学合成化妆品添加剂，并可作为保健食品添加剂起到补充皮肤胶原的作用。
　　
　　鱼胶原肽的具体的作用机理可以分为竞争性抑制，即通过自身与酪氨酸酶直接结合，竞争多巴的结合位点，加速黑色素的分解与排泄，从而减少黑色素的沉积，或者是非竞争性抑制，即通过螯合铜离子，从而使酪氨酸酶失活，同时也可以抑制从多巴色素到5，6-二羟基吲哚-2-羧酸的互变反应，减少黑色素的形成。鱼胶原肽的作用机理是竞争性抑制，或是非竞争性抑制，抑或两者都有，需要进一步的研究加以证实。
　　
　　[参考文献]
　　[1]杜孝元，刘 玮，史 飞,等. 酪氨酸酶活性抑制实验及其在祛斑美白化妆品功效评价中的应用[J].中国美容医学，2005，14（6）：740-742.
　　[2]王白强,曾晓军.酪氨酸酶活性的抑制研究及皮肤美白化妆品的研制[J].福建轻纺，2002，（7）：1-6.
　　[3]陈清西，林建峰，宋康康.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].厦门大学学报：自然科学版，2007，46（2）：274-282.
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　　[5]Goetghebeur M，Kermasha S. Inhibition of polyphenol oxidase by copper-metallothionein from Aspergillus niger [J].Phytochemistry，1996，42（4）：935-940.
　　[6]摘译自 胶原水解物的皮肤渗透性及生物功能性[J].日本写真学会志，2004，67（4）：397-401.缪进康，译. 明胶科学与技术，2006，26（1）：33-39.
　　[7]戴 岚，宋白薇.化妆品新原料金目鲷鱼胶原蛋白的开发和特性[J].日用化妆品科学，2006，29（4）：22-25.
　　[8]丁卓平，刘振华，李仁冬，等.罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取条件的研究[J].水产科技情报，2006，33（4）：190-192.
　　[9]刘宇红，董银卵，李才广.皮肤化学美白剂抑制酪氨酸酶活性的研究[J].日用化学工业，2001，31（1）：21-23.
　　[10]李 莉，苗小春.酪氨酸酶活力的测定及其两种抑制剂的抑制作用[J].北京日化，1995，53（1）：9-14.
　　
　　[收稿日期]2008-04-16[修回日期]2008-09-10
　　编辑/何志斌