基于网络药理学探讨丹参饮治疗心力衰竭的作用机制

刘文锐，瞿惠燕，杨天舒，唐巧林，周 华

心力衰竭是指在多种因素作用下心脏结构和(或)功能发生异常改变，引起心脏收缩和(或)舒张功能障碍的一组临床综合征，是心血管疾病的“最后主战场”[1]。《中国心血管健康与疾病报告2020》指出，我国心血管病患病率处于持续上升趋势，推算现患病人数达3.3亿例，其中心力衰竭约890万例[2]。目前针对心力衰竭尚无特异性的西药，且西药作用靶点常以某个单一靶点为主，中药复方可缓解心力衰竭临床症状，从多途径、多靶点、多通路干预心室重构，具有广阔的应用前景[3]。

丹参饮首载于陈修园之《时方歌括》卷下，原方由丹参、砂仁、檀香3味中药组成，主治心腹诸痛，具有行气活血、化瘀止痛之功效。丹参饮广泛应用于治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血等心血管疾病和慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡等胃肠道疾病[4]。现代研究表明，丹参饮具有减轻心肌细胞缺血再灌注损伤[5]、抗冠状动脉粥样硬化[6]、保护内皮细胞[7]、抗心肌纤维化[8]、抑制心肌细胞凋亡[9]等作用。

网络药理学利用大数据平台将生物网络与其他学科交叉融合，从整体阐述药物与疾病之间的有机联系，体现了中医整体观念的思想，为研究中药复方提供了一种方法[10]。本研究采用网络药理学方法探讨丹参饮治疗心力衰竭的潜在作用机制，为今后丹参饮的研究提供了思路。

1.1 丹参饮活性化合物及靶点筛选 通过TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索丹参、砂仁和檀香的活性成分。筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18。将纳入的活性化合物通过TCMSP数据库进行成分的靶点预测，所有靶点经UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)校正，去掉非人类靶点。

1.2 心力衰竭靶点基因的筛选 以“heart failure”为关键词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、NCBI基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及OMIM数据库(https://www.omim.org/)进行人类基因检索。其中，GeneCards数据库获得的靶点将得分进行中位值筛选以获得相关的靶点。利用韦恩图制作软件Venny 2.1得到丹参饮活性成分与心力衰竭的共有靶点。

1.3 丹参饮“中药-成分-靶点”蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建 将药物疾病共有靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，得到PPI网络。将PPI网络导入Cystoscape 3.8.0中，运用NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，通过度值(Degree)排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点。打开MCODE模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。

1.4 治疗靶点的基因本体(GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将药物疾病共有靶点进行GO的生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cell component，CC)富集分析和KEGG通路富集分析，引用STRING数据库，将校正P值<0.05的项目进行筛选。最后将成分-疾病-通路-靶点网络文件导入Cytoscape 3.8.0进行通路网络图的绘制，直观展示中药活性成分在治疗心力衰竭过程中的多成分、多靶点的作用特点。

2.1 丹参饮有效活性化合物 通过TCMSP数据库筛选活性化合物，筛选条件为OB≥30%、DL≥0.18，共得到78个活性化合物，其中丹参65个、砂仁10个、檀香3个，活性化合物相应靶点264个。其中丹参活性化合物包括1，2，5，6-四氢丹参酮、茯苓甾醇、多孔司特-5-烯-3β-醇、脱氢蒽酮ⅡA、黄芩苷、木犀草素等；
檀香活性化合物包括异鼠李素、木犀草素、异牡荆黄素；
砂仁活性化合物包括24-乙基胆甾醇-4-烯-3-酮、多孔司特-5-烯-3β-醇、谷甾醇醋酸酯、β谷甾醇、豆甾醇、维生素E等。丹参饮主要活性成分基本信息见表1。

表1 丹参饮的主要活性成分

(续表)

(续表)

2.2 丹参饮治疗心力衰竭的潜在作用靶点 通过GeneCards数据库、NCBI基因数据库及OMIM数据库获取心力衰竭靶点，其中，GeneCards数据库获得1 495个相关靶点，NCBI数据库获得1 296个相关靶点，OMIM数据库获得143个相关靶点。将这3个数据库的基因合并删除之后，得到2 273个心力衰竭相关基因。将筛选出的丹参饮活性化合物靶点与心力衰竭靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，得到86个共有靶点。详见图1。

图1 丹参饮治疗心力衰竭潜在靶点的韦恩图

2.3 “丹参饮有效成分-心力衰竭-关键靶点”PPI网络构建与分析结果 将药物-疾病共有靶点输入STRING

数据库，得到PPI网络，该网络中有86个节点、1 002条边，平均度值为23.3。详见图2、图3。图3中的节点颜色和大小根据度值调整，节点越大，颜色越红，度值越大，线粗到细表示边介数(edge betweenness)从大到小。基于PPI网络进行拓扑分析，共筛选出36个关键靶点蛋白，其中，居前20位关键靶点蛋白为蛋白激酶B(AKT1)、白细胞介素-6(IL6)、表皮生长因子受体(EGFR)、胱天蛋白酶3(CASP3)、热休克蛋白90α家族A类成员1(HSP90AA1)、低聚果糖(FOS)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、环氧合酶2(PTGS2)、雌激素受体α(ESR1)、c-Jun氨基末端激酶(JUN)、重组人信号转导与转录激活因子3(STAT3)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、MYC、酪氨酸激酶受体2(ERBB2)、人内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、细胞周期素D1重组蛋白(CCND1)、核因子κB抑制蛋白α重组蛋白(NFKBIA)、胱天蛋白酶8(CASP8)、糖原合成酶激酶-3(GSK3B)、白细胞介素-10(IL10)，详见图4。通过MCODE模块进行基因簇分析和核心靶点的筛选，共得到3个基因簇和3个核心基因，核心基因为DRD2、PTPN1、IL10，详见表2和图5。

图2 丹参饮治疗心力衰竭潜在靶点的PPI网络图(STRING网站)

图3 丹参饮治疗心力衰竭潜在靶点的PPI网络图(Cytoscape软件)

图4 PPI网络拓扑分析靶点排序(居前20位)

表2 MCODE聚类分析详细信息

图5 MCODE聚类分析核心基因簇

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共富集到1 900条生物过程、106项分子功能、54项细胞组分。涉及的主要生物过程包括血液循环调节、血管直径调节、血管收缩调节、上皮细胞增殖调控、活性氧代谢过程、凋亡信号调控、DNA结合转录因子活性的调控、肾上腺素能受体信号通路、平滑肌细胞增殖的调控；
涉及的主要细胞组分包括膜、膜筏、突触前膜、突触后膜、线粒体外膜、囊泡、蛋白激酶复合物等；
涉及的分子功能包括G蛋白偶联胺受体活性、泛素样蛋白连接酶结合、核受体活性、配体激活转录因子活性、细胞因子受体结合、DNA转录因子结合、类固醇激素受体、生长因子受体结合、肾上腺素能受体结合、核转录因子(NF)-κB结合等。详见图6、图7。

图6 丹参饮治疗心力衰竭潜在核心靶点的GO富集分析柱状图

图7 丹参饮治疗心力衰竭潜在核心靶点的GO富集分析气泡图

对KEGG通路富集分析，依据校正P值<0.05，共富集到165条丹参饮治疗心力衰竭的信号通路，将其中富集显著的20条信号通路绘制成柱状图和气泡图。20条信号通路包括脂质与动脉粥样硬化、内分泌抵抗、乙型肝炎、化学致癌-受体激活、人巨细胞病毒感染、大肠癌、IL17信号通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-糖基化终产物受体(AGE-RAGE)信号通路、癌症中的蛋白多糖、膀胱癌、松弛素信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、弓形虫病、非小细胞肺癌、利什曼病、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、恰加斯病、PI3K-Akt等信号通路。详见图8、图9。

图8 丹参饮治疗心力衰竭潜在核心靶点的KEGG通路分析柱状图

图9 丹参饮治疗心力衰竭潜在核心靶点的KEGG通路分析气泡图

2.5 丹参饮活性成分-心力衰竭-通路-靶点网络图构建 运用Cytoscape 3.8.0进行通路网络图的绘制，直观展示中药活性成分在治疗心力衰竭过程中的多成分、多靶点的作用特点。详见图10。

图10 丹参饮活性成分-心力衰竭-通路-靶点网络图(蓝色为丹参饮活性化合物，黄色为丹参饮活性化合物作用于心力衰竭的靶点，绿色为最显著的前20条通路，红色为疾病即心力衰竭，紫色为中药)

心力衰竭归属于中医学“心水病”范畴，为本虚标实之证，主要病机为气虚血瘀[11]。丹参饮为临床治疗气虚血瘀证的常用方剂，丹参饮中丹参活血而补血，《名医别录》记载：“丹参养血，去心腹痼疾结气”，故有丹参一味功同四物之说；
砂仁醒脾开胃，中州健运则气血生化有源；
檀香行气活血，祛瘀生新，瘀血不去则新血不生。临床研究表明，丹参饮联合常规西药治疗慢性肺源性心脏病心力衰竭能提高病人心功能，改善生活质量[12]。目前丹参饮作用于心力衰竭的靶点和通路尚不明确，因此本研究通过网络药理学探讨丹参饮治疗心力衰竭的作用机制，将为今后的研究奠定基础。

PPI网络拓扑分析显示，丹参饮治疗心力衰竭的核心靶点有20个，居前5位度值最高分别是AKT1、IL6、EGFR、CASP3、HSP90AA1。AKT信号可促进细胞生长、增殖和生存[13]。AKT1信号的持续激活将诱发广泛的心脏肥大，导致心脏严重的收缩功能障碍，进而加重心力衰竭发生和发展[14]。IL6作为一种炎性细胞因子，可促进心肌细胞增殖，进而刺激心肌细胞外基质的合成，并通过增强炎症信号通路传导，加重心室重构程度[15]。EGFR是位于细胞膜表面且有酪氨酸激酶活性的糖蛋白受体，具有调节细胞增殖、抗炎、抗氧化信号传导的功能[16]。有研究显示，血管紧张素Ⅱ通过EGFR活化促进体内心脏肥大发展[17]。CASP3参与细胞凋亡途径，可促使心肌细胞中肌钙蛋白的降解，心肌细胞发生凋亡，导致心脏收缩功能逐渐丧失[18-19]。

GO功能富集分析可知丹参饮治疗心力衰竭主要与血管的调节、细胞凋亡、细胞增殖、能量代谢等生物过程有关。细胞组分主要以膜结构为主，推测丹参饮发挥治疗作用的关键机制为干预人体神经-体液机制。KEGG通路富集结果显示，丹参饮治疗心力衰竭的相关通路包括IL17、AGE-RAGE、松弛素、HIF-1、PI3K-Akt等。IL17是一种亲炎细胞因子，由T辅助细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等合成，可促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达，进而引起心肌细胞凋亡，同时激活基质金属蛋白酶，致使心肌细胞外基质合成增加，导致心肌纤维化发生[20-21]，在心力衰竭中发挥着重要作用，IL17水平随着心功能的恶化而升高[22]。AGE-RAGE信号通路是导致糖尿病心肌病的常见信号通路，有研究表明，AGEs/RAGE水平与心肌纤维化呈正相关[23-24]，AGE-RAGE可刺激人体肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活、NF-κB炎性因子、转化生长因子β1(TGF-β1)致纤维化因子的产生，加速心肌纤维化进程，从而加重心力衰竭[25-26]。松弛素是一种肽类激素，具有扩张血管、保护心脏细胞的作用，通过激活多个信号转导通路，抑制炎症和肌纤维细胞激活，发挥抗纤维化的作用[27-29]。有研究发现，松弛素家族胰岛素样肽6(INSL6)抑制血管紧张素Ⅱ导致的心脏收缩功能障碍和心脏纤维化，延缓心力衰竭发生[30]。HIF-1是调控缺氧反应的重要转录因子，HIF-1α是HIF-1的调节和功能亚基，通过调节血管新生、调控氧代谢和糖代谢，从而达到抗心肌缺氧及改善心肌代谢的目的[31-32]。射血分数正常的心力衰竭病人病情严重程度和不良预后与血清HIF-1α水平呈正相关[33]。PI3K-Akt信号通路是调节心肌肥厚的重要靶点通路，通过调节血管形成、细胞凋亡、氧化应激等过程参与心室重构[34]。有研究发现，PI3K-Akt信号通路的磷酸化可影响相关凋亡蛋白表达，从而降低心肌细胞凋亡，改善心功能[35-36]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法对丹参饮治疗心力衰竭的靶点和通路进行了初步探讨，证实了丹参饮多途径、多靶点治疗心力衰竭的特点，为丹参饮治疗心力衰竭提供了理论依据，同时为今后的研究指明了方向，但仍需动物实验进一步验证结果。