新制和老化微塑料对土壤阿特拉津消减的影响

迟 杰，罗 洁，谭明霞，童银栋

（天津大环境科学与工程学院，天津 300072）

随着塑料制品的大量使用，产生的塑料废弃物在土壤中不断积累.截至2015年，全球64亿吨的塑料垃圾有大约 79%积累在陆地垃圾填埋场或自然环境[1].其中，长期残留于土壤环境中的塑料薄膜会在各种环境因子和生物作用下逐渐老化破碎形成粒径小于5mm的微塑料，最终导致薄膜源的微塑料逐渐在土壤中蓄积[2].此外，用来改善土壤肥力的污水污泥再利用是土壤微塑料的主要来源.由于具有粒径小、比表面积大的特点，微塑料对有机污染物具有较强的吸附作用[3].被吸附的污染物可随微塑料进入食物链，对生态系统产生潜在影响.微塑料还会改变土壤理化性质(如孔隙度、团粒结构等)或成为土壤团聚体的一部分，进而改变微生物活性[4].这些变化都将影响土壤中有机污染物的迁移转化行为.

蚯蚓作为土壤中普遍存在的动物，在土壤生态系统的肥力、代谢、结构与功能的维持方面发挥着重要作用，已被广泛用于评价土壤中污染物的生物有效性和生态风险.蚯蚓的活动还可以促进微塑料在土壤内的移动，使微塑料与土壤的接触更充分，有助于微塑料对污染物的吸附[5].同时，蚯蚓可以吞食吸附污染物的微塑料，使其体内浓度发生改变.因此，研究土壤中污染物的消减对蚯蚓和微塑料共存的响应机制具有重要意义.

阿特拉津是一种有机氯农药.自投入商业生产以来，在世界范围内得到了大面积的推广和使用.近年来，阿特拉津在污染地区被普遍检测出[6-7].有研究表明，无论是陆地动物还是水中的鱼类甚至是人类，长期接触阿特拉津都会有致癌的风险[7].与新制微塑料相比，老化后微塑料表面出现裂缝，孔容和比表面积增大，表面含氧官能团增加，致使微塑料吸附污染物的能力发生改变[8].为此，笔者选取了新制和老化聚乙烯(PE和 APE)，研究了它们对阿特拉津的吸附特性，并考察了有无蚯蚓情况下微塑料对土壤和孔隙水中阿特拉津浓度以及菌群结构的影响.在此基础上，探究了这两种微塑料对土壤中阿特拉津消减的影响机制.

1.1 实验材料

聚乙烯(PE)微塑料购于东莞市中诚塑胶原料经营部(粒径范围 0.106～0.180mm).甲醇浸泡、干燥后备用.将清洗后的 PE微塑料置于培养皿中，加入50mL的H2O2(体积分数18%)，盖上石英玻璃片，暴露于紫外线下300h[9].期间每24h摇匀1次并及时补充溶液.取出微塑料，清洗、干燥后过筛，得到粒径范围0.106～0.180mm的老化微塑料(APE).

表层土壤(0～10cm)采自天津市津南区(北纬38°58′59″，东经 117°20′59″).风干、过 2mm 筛后，取1/6质量实验土壤，加入阿特拉津的丙酮溶液.待丙酮挥发，用余下的 5/6未染毒土壤与已染毒土壤混合，过 3次 2mm 筛后得到染毒土壤(阿特拉津浓度＝10.01mg/kg).土壤基本理化性质：pH值为8.62，有机质含量为 1.54%，机械组成为 7.23%砂粒/56.72%粉粒/36.05%黏粒.

实验采用威廉环毛蚓(Pheretimaguillelmi).使用前，将蚯蚓放到未染毒的土壤(含水率为 65%)中驯养 7～14d.期间保持温度((20±3)℃)和透气.驯养结束后，选择成年(有明显生殖环)的蚯蚓进行清肠处理，称重后备用.

1.2 实验设计

1.2.1 吸附实验

分别称取 5mg的 PE或 APE到 40mL的Agilent瓶中.加入 40mL不同初始浓度的阿特拉津溶液(1000～14000μg/L；
为避免溶剂效应，引入甲醇的体积分数不超过0.1%)，盖上盖子，置于25℃恒温摇床上以 150r/min的速度、避光条件下振荡 48h使吸附达平衡(吸附动力学预实验结果显示这两种微塑料吸附阿特拉津到达平衡时间为 36h).取出样品瓶，静置 30min.将样品瓶中溶液转移至玻璃离心管中在 4000r/min下离心 20min，取出上清液，用高效液相色谱仪测定阿特拉津的浓度.所有实验做 3个平行.

1.2.2 降解实验

分别设置5个有蚯蚓和无蚯蚓的处理组，包括土壤(CK)、添加 0.2%(0.2%PE和 0.2%APE)和 2%微塑料的土壤(2%PE和 2%APE).同时设置相应的灭菌处理组(添加0.2% HgCl2，质量比).每个处理组3个平行.向一系列 500mL玻璃烧杯中加入 200g不含或含有微塑料的染毒土壤.充分混匀后，加去离子水使土壤饱和含水率为 65%.另外，在蚯蚓处理组中向每个烧杯加入5条健康的蚯蚓，再用纱布覆盖烧杯口以防止蚯蚓逃逸.将所有烧杯放在培养箱中，控制温度为(25±1)℃，定期补水以控制含水率.实验共运行28d.

采集实验初始和结束的土壤样品，分为 3份.一份土壤样品用于测定孔隙水中污染物浓度；
另外两份土壤样品冷冻干燥 24h后，一份用于测定土壤菌群结构，另一份研磨过 80目筛后用于测定阿特拉津浓度.此外，实验结束时从蚯蚓处理组中取出蚯蚓，然后用去离子水洗净并做清肠处理，然后冷冻干燥，用于测定蚯蚓体内阿特拉津浓度.

1.3 分析方法

1.3.1 微塑料的表征

采用红外光谱仪测定PE和APE微塑料样品的表面官能团.根据红外光谱结果计算微塑料的羰基指数(CI).CI是羰基带最大吸光度与参考带的比值[10]，计算公式为

1.3.2 水相阿特拉津的测定和吸附等温线模型

采用高效液相色谱(紫外检测器)测定吸附实验上清液和土壤孔隙水中阿特拉津的浓度.色谱柱为C18(4.6mm×150mm)，柱温 30℃，流动相为 95%的甲醇溶液，流速为 0.5mL/min，进样量为 10μL.样品出峰时间约为6min.

用 Freundlich模型拟合阿特拉津在微塑料上的吸附行为.模型公式为

式中：Ce为吸附质的平衡浓度，μg/L；
Qe为平衡时的吸附量，μg/kg；
Kf是吸附能力系数，；
N表示点能量不均匀因子，可以反映特定吸附过程中能量的大小和变化，通常用来表示非线性的程度.

1.3.3 土壤中阿特拉津的测定

采用超声法提取土壤中阿特拉津[11].简而言之，称取过筛后的土壤样品于安捷伦瓶中，加入正己烷与丙酮的混合液(1∶1，体积比).超声、离心后，将上清液转移至K-D浓缩管.重复操作3次，合并滤液.滤液经旋转蒸发至近干后转移至硅胶柱净化.将收集的洗脱液氮吹至近干后定容，用 GC-MS测定阿特拉津的浓度.气相色谱柱的升温程序如下：初始温度100℃，以20℃/min升温至280℃，保持2min，共运行 9min；
不分流进样；
检测器与进样口的温度均为250℃；
接口温度为280℃.质谱四级杆温度为150℃，离子源温度为 230℃，EI源为 70eV，氦气流量为1.0mL/min.土壤中阿特拉津回收率为 87.8%～90.0%.

1.3.4 蚯蚓体内阿特拉津的测定

将冷冻干燥后的蚯蚓在研钵中磨碎.将蚯蚓粉末置于 50mL离心管中，加入 20mL丙酮超声萃取30min后于摇床上以 200r/min速度振荡 30min.取出离心管，于4000r/min速度下离心30min.吸出萃取液至K-D浓缩管中.重复上述步骤3次，合并萃取液.后续步骤和GC-MS条件同第1.3.3节.

1.3.5 土壤菌群结构

土壤样品中菌群结构和多样性分析，以 16s rDNA V3-V4区测序结果为数据基础.土壤DNA经提取、扩增和净化后进行文库构建和上机测序[12].

1.3.6 统计分析

使用 Excel 2010进行数据计算与列表；
使用Origin 9.0作图.用 SPSS 25.0对不同指标间进行Pearson相关性分析(α＝0.05).

2.1 微塑料的表征

图1为两种微塑料的红外光谱图.可见，PE在2920cm-1、2850cm-1、1467cm-1、1375cm-1和721cm-1处出现了聚乙烯的亚甲基振动峰[13].除了上述特征峰，APE还在1720cm-1处出现了羰基拉伸振动峰，在 1610cm-1处出现了芳环 C＝C或酮、醛类以及羧化物的 C＝O伸缩振动峰[12].通常 1610cm-1处的振动峰作为1720cm-1处峰的肩峰同时出现.

图1 PE和APE的红外光谱Fig.1 FT-IR spectra of PE and APE

已有的研究指出，聚合物在老化过程中形成了多种不同的化学基团，主要包括羰基(1690～1810cm-1，集中在 1715cm-1)和羟基(3100～3700cm-1，集中在 3300～3400cm-1).其中，羰基吸收带位置稳定，强度高，无干扰带，是跟踪光解过程的理想指示物[14].本研究中，老化后羰基的变化最明显，与文献[15-16]结果一致.根据式(1)计算得到，老化后PE的CI值从0.04升至0.27.这说明老化后PE的表面极性增加.

2.2 微塑料对阿特拉津的吸附

图2为两种微塑料吸附阿特拉津等温线.吸附等温线与 Freundlich模型吻合良好(R2＝0.96～0.97).PE和APE吸附阿特拉津等温线的N值分别为 0.89和 0.85，接近 1，说明老化前后 PE对阿特拉津的吸附均由分配作用主导.这与文献[17]报道结果一致.

图2 PE和APE对阿特拉津的吸附等温线Fig.2 Adsorption isotherms of atrazine to PE and APE

从吸附能力看，APE的 lgKf值(1.29)略高于PE(1.27).本研究的 FT-IR结果显示，老化后 PE的CI值增大，表面极性增加.阿特拉津属于极性化合物.老化后微塑料表面极性的增大是影响阿特拉津在微塑料上吸附量的主要原因.这与 Gao等[18]的研究结果一致.

2.3 土壤菌群结构

有蚯蚓和无蚯蚓土壤样品中细菌多样性结果如表1所示.可见，添加微塑料分别使无蚯蚓和有蚯蚓土壤OTUs降低了 7.2%～22.6%和 10.6%～21.1%；
蚯蚓的存在使 OTUs下降了 27.9%～39.4%.多样性指数(Shannon与Simpson)的变化趋势与OTUs基本一致.这些数据说明蚯蚓的存在和微塑料的添加都会改变土壤菌群的多样性.

表1 土壤样品中细菌的多样性Tab.1 Bacterial diversity in soil samples

从相对丰度前20的菌属中检出了7个具有降解阿特拉津能力的菌属(见表2)，包括 Aeromonas、Bacillus、Rhodococcus、Nocardioides、Shewanella、Sphingomonas和Arthrobacter[6-7,19].有蚯蚓土壤中优势阿特拉津降解菌的相对丰度之和(13.0%～25.1%)是无蚯蚓土壤中(8.7%～12.1%)的 1.1～2.7倍，这与Aeromonas相对丰度显著增加有关.据报道，Aeromonas是蚯蚓粪便中的优势菌属，其最高占比可达 39%[6].此外，无蚯蚓情况下，添加微塑料使土壤中阿特拉津降解菌相对丰度之和降低了 4.0%～17.8%.有蚯蚓情况则相反，添加微塑料使优势降解菌相对丰度之和增加了 39.9%～92.7%.这是因为添加微塑料可能会刺激蚯蚓产生更多的肠道黏液，对土壤菌群丰度的增加产生积极的影响[5].

表2 土壤样品中阿特拉津降解菌丰度Tab.2 Abundance of atrazine-degrading bacteria in soil samples

2.4 微塑料对土壤孔隙水中阿特拉津浓度的影响

已有的研究认为，吸附到土壤或沉积物上的污染物只有解吸下来才能被微生物利用[12].因此本文通过测定土壤孔隙水中阿特拉津浓度的变化，探讨老化前后 PE微塑料对土壤中阿特拉津生物可利用性的影响.从图3数据可见，实验期间无蚯蚓和有蚯蚓土壤孔隙水中阿特拉津的浓度均随时间大幅下降.而且有蚯蚓处理组的降幅(86.0%～87.3%)显著高于无蚯蚓处理组(56.8%～65.9%).这是因为蚯蚓的存在提高了降解菌的数量(见第 2.3节)，加速了阿特拉津的降解.蚯蚓吸收也起一定作用.

图3 实验期间有无蚯蚓土壤孔隙水中阿特拉津的浓度Fig.3 Atrazine concentrations in porewater of soils with or without earthworms during the experiment

此外，孔隙水中阿特拉津浓度下降的幅度还随着微塑料添加量的增加而增大.将实验初始孔隙水中阿特拉津浓度与两种微塑料的 lgKf值做相关性分析，结果显示两者之间显著负相关(0.2%添加量：r＝－0.928，n＝9，p＝0.002；
2%添加量：r＝－0.983，n＝9，p＝0.000).这说明微塑料吸附能力越强，对土壤中阿特拉津的固定作用越大，从而降低了土壤中阿特拉津的生物可利用性.

2.5 微塑料对土壤中阿特拉津消减的影响与机制

灭菌实验结果显示(图4(a))，实验期间各处理组土壤中阿特拉津浓度显著变化(p＜0.05).其中，对照组土壤中阿特拉津的消减率(38.0%)显著高于微塑料添加组(15.7%～25.8%)，说明非生物过程在阿特拉津消减中的作用不可忽视.由于灭菌实验是在黑暗环境中进行的，排除了光解作用.可以认为，阿特拉津的消减是因化学水解所致，这与文献[20]报道一致.

图4(b)和(c)为实验结束时未灭菌土壤中阿特拉津的残留浓度和消减率.可见，无蚯蚓和有蚯蚓土壤中阿特拉津的浓度均显著下降(p＜0.05).其中，对照组的降幅最小；
微塑料的添加量越高降幅越大.与之对应的土壤中阿特拉津的消减率分别为 28.2%～54.5%和 42.1%～67.8%，显著高于灭菌实验，说明土壤中阿特拉津的消减途径还包括微生物降解.这是由于相比于灭菌土壤，未灭菌土壤中阿特拉津降解菌(见第 2.3节)中含有多种降解基因，参与调控了阿特拉津的脱氯、脱烷基、水解和开环过程，使其生成羟基阿特拉津、脱乙基阿特拉津、脱异丙基阿特拉津、脱异丙基羟基阿特拉津等一系列代谢产物[21].比如，Arthrobacter携带的atrB、atrC和trzN基因可以将阿特拉津转化为毒性较低的氰尿酸[22]；
再者，Rhodococcus也能通过 atrA基因有效降解阿特拉津生产脱烷基代谢产物[23]，通过两种或多种降解菌的共代谢，阿特拉津最终完全降解为CO2和NH3.所以，土壤中阿特拉津降解菌的存在可以加速阿特拉津的降解.

图4 实验结束时土壤中阿特拉津浓度（柱）和消减率（线）Fig.4 Concentrations （column） and dissipation rates（line） of atrazine in the soil at the end of the experiment

但是，在有蚯蚓土壤中阿特拉津在蚯蚓体内的富集也是潜在的消减途径.实验期间各处理组蚯蚓体内阿特拉津的浓度如图5所示.可见，蚯蚓体内阿特拉津的浓度在1.48～2.94mg/kg之间.微塑料的加入显著降低了蚯蚓体内阿特拉津的浓度；
随着微塑料添加量的增大蚯蚓体内阿特拉津的浓度下降(p＜0.05)，这与前人研究结果一致[24].蚯蚓对阿特拉津的富集主要包括两个途径：通过表皮吸收孔隙水中的阿特拉津，或者通过吞食含有阿特拉津的土壤.添加微塑料不仅降低了孔隙水中阿特拉津的浓度(见第2.4节)，还能抑制被吞食土壤中阿特拉津的解吸.此外，由于被蚯蚓摄食的微塑料在其肠道停滞时间较短，无法使微塑料吸附的阿特拉津与肠液之间达到解吸平衡，也会导致蚯蚓富集阿特拉津量的较少[25].根据蚯蚓体内阿特拉津的浓度计算，蚯蚓富集对土壤中阿特拉津消减率增幅的贡献很小(＜0.3%)，可以忽略不计.

图5 蚯蚓体内阿特拉津的富集浓度Fig.5 Concentrations of atrazine in earthworms

从图4(b)和(c)中还可以看出，蚯蚓的存在使各处理组土壤中阿特拉津的消减率显著提升(p＜0.05，增幅为 24.5%～49.4%)，并且消减率增幅的顺序为2%APE组＞0.2APE组＞2%PE组＞0.2%PE组＞对照组.这说明蚯蚓可以显著加速土壤中阿特拉津的消减，而且微塑料老化和添加量对阿特拉津的消减也起重要作用.同样地，Lin等[26]的研究表明蚯蚓的添加显著促进了土壤中有机污染物的去除.这与蚯蚓的扰动增加了降解菌的数量，从而促进了有机污染物的微生物降解有关[27].进一步的相关性结果显示，无论蚯蚓是否存在，土壤中阿特拉津的消减率与实验初始孔隙水阿特拉津的浓度均显著正相关(无蚯蚓：r＝0.973，n＝21，p＝0.000；
有蚯蚓：r＝0.967，n＝21，p＝0.000).根据前面的分析可知，土壤中阿特拉津的消减不仅包括化学水解，还包括微生物降解，因此孔隙水中阿特拉津是其消减的主要来源.

根据物料守恒分别计算了无蚯蚓和有蚯蚓土壤中化学水解和生物降解对阿特拉津消减的贡献(图6).可见，无蚯蚓土壤中阿特拉津的生物降解的占比＜化学水解的占比(0.2%PE处理组除外，为生物降解的占比＞化学水解的占比).相反，有蚯蚓土壤中生物降解的占比＞化学水解的占比.蚯蚓的存在使土壤中阿特拉津生物降解的占比提高了 26.7%～52.2% (p＜0.05).这是因为蚯蚓的存在大幅提高了土壤降解菌的相对丰度(见第 2.3节)，促进了阿特拉津的微生物降解.这也是蚯蚓加速土壤中阿特拉津消减的主要原因.

图6 实验结束时无蚯蚓和有蚯蚓土壤中阿特拉津的物料守恒Fig.6 Mass balances of atrazine in soil with and without earthworms at the end of the experiment

(1) 新制和老化 PE微塑料吸附阿特拉津的等温线符合 Freundlich模型(R2＝0.96～0.97).老化后PE的吸附能力(lgKf)略有增强，与PE微塑料表面极性变化有关.

(2) 蚯蚓的存在和微塑料的添加均会影响土壤菌群结构.其中，蚯蚓是影响土壤菌群结构的主控因素.从土壤中检出 7个具有降解阿特拉津能力的优势菌属，包括 Rhodococcus、Sphingomonas、Aeromonas、Bacillus、Nocardioides、Shewanella 和Arthrobacter.蚯蚓的存在显著增加了土壤中优势阿特拉津降解菌的相对丰度.无蚯蚓土壤中添加微塑料降低了优势阿特拉津降解菌的相对丰度，而有蚯蚓土壤中刚好相反.

(3) 蚯蚓的存在可以显著加速土壤中阿特拉津的消减，而且微塑料的老化和添加量对阿特拉津消减率的变化也起重要作用.物料守恒结果显示，化学水解和生物降解是土壤中阿特拉津消减的主要途径.无蚯蚓土壤中阿特拉津生物降解的占比＜化学水解的占比(0.2%PE处理组除外).有蚯蚓土壤中则相反.蚯蚓通过提高土壤降解菌的相对丰度显著提升了微生物降解的比例.这也是蚯蚓加速土壤中阿特拉津消减的主要原因.