经典瞬时感受器电位通道对内皮细胞和平滑肌细胞增殖所引起的阻塞性病变的影响

闫文丽，唐学义，张晓宇

1.安阳市第六人民医院呼吸危重症科，河南 安阳 455000；

2.河南省人民医院·郑州大学人民医院呼吸与危重症医学科，河南 郑州 450003

在全球每年死亡人数中，心血管疾病占1/3，我国心血管疾病死亡率也居高不下［1］。动脉粥样硬化是冠心病、脑卒中及心肌梗死等心血管疾病的发病基础。怎么预防及治疗心血管疾病，是目前医学研究的热点。深入研究动脉粥样硬化的发病机制及探索其靶点非常重要。经典瞬时感受器电位通道（TRPC）是Ca2+身体性非选择性的阳离子通道，TRPC6能介导受体操纵的钙流入，表达参与疾病的发生、发展，尤其在心血管相关疾病的病理过程中有着重要作用［2］。本研究就TRPC对内皮细胞和平滑肌细胞增殖所引起的阻塞性病变的影响进行了探讨，现将结果报告如下。

1.1 一般资料

1.1.1 人体实验 选取尸检标本进行研究，尸检标本选择生前患有高血压及脑血管疾病者。此次检测方案经医院伦理委员会批准通过。尸检标本的尸解经其家属同意后实行。

1.1.2 动物实验 周龄为6周的、购于北京维通利华公司的ApoE -/-小鼠为模型组，经高脂饲料喂养2周；
购于空军军医大中心的C57BL/6J小鼠为对照组，经普通饲料喂养12 周。ApoE -/-小鼠经C57BL/6J 小鼠回交10 代以上做基因敲除。

1.2 方法

1.2.1 经免疫组织化学法检测颈动脉斑块中TRPC6 表达取颈动脉分叉位置，血管壁出现动脉粥样硬化明显的斑块组织进行检测，并取其周围血管壁病变不明显的组织为对照组。去除残留血液、石蜡包埋；
制作切片；
烘箱融化石蜡、甲苯、梯度乙醇水化；
抗原修复；
透膜、内源过氧化氢酶灭活；
封闭；
孵育；
显色；
苏木素染色液复染；
脱水等处理后，树胶封片，显微镜拍照，取5个视野经分析图像计算平均光密度，取均值。

1.2.2 小鼠建模后于其腹腔注射戊巴比妥钠麻醉 将胸腹腔打开，灌注3～4 mL 生理盐水至左心室至肝脏发白，随脊柱分离主动脉，一起剪下心脏，放入PBS 缓冲液干粉，显微镜下剥离心脏和血管组织，沿主动脉根部剪下心脏，纵向剖开主动脉为Y 型。把主动脉放入4%多聚甲醛中24 h、油红O 染液浸染4 h，再用异丙醇分化多次至动脉粥样硬化斑块为红色、动脉壁为白色。经蒸馏水冲洗后拍照，经Image-Pro Plus 6.0统计整个主动脉面积中的斑块面积占比。另外经免疫组织化学法检测小鼠主动脉的动脉粥样硬化斑块中的TRPC6 表达。基因敲除后，经CD68 免疫组织化学染色法检测小鼠主动脉的动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞含量，经天狼猩红染色法检测动脉粥样硬化斑块中的胶原纤维含量。采用超声影像技术检测小鼠的颈部总动脉情况。

1.3 观察指标

（1）TRPC6 在颈动脉动脉粥样硬化中的表达情况。（2）高脂饲养下的动脉粥样硬化形成情况。（3）TRPC6在小鼠主动脉动脉粥样硬化中的表达情况。（4）基因敲除后，动脉动脉粥样硬化斑块中的平滑肌细胞及胶原纤维含量情况。（5）基因敲除后，血管壁增厚及血流阻力情况。

2.1 石蜡切片中的IHC染色结果

动脉粥样硬化不明显的血管中，其血管内膜及中膜上均有TRPC6表达。而有明显动脉粥样硬化的血管中，血管形态破坏改变，中膜变薄，血管内斑块组织较多，TRPC6表达显著更高。经Image-Pro Plus6.0 计算IHC 阳性染色平均光密度值显示，动脉粥样硬化血管发生明显的平均光密度为（0.006±0.001），未有明显动脉粥样硬化平均光密度为（0.041±0.012），动脉粥样硬化血管发生明显的显著更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 高脂饲料喂养的小鼠

经高脂饲料喂养12周后的小鼠动脉上出现明显的动脉粥样硬化斑块。说明高脂饲料喂养12 周后的小鼠建模成功。

2.3 IHC检测结果

经IHC检测法显示，对照组小鼠血管壁上的TRPC6表达弱，模型组动脉粥样硬化斑块有明显的TRPC6 阳性显示。经软件统计其阳性染色平均光密度值，模型组（0.004±0.010）高于对照组（0.063±0.012），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 基因敲除后结果

对小鼠进行基因敲除后，经CD68 抗体免疫染色评价出其巨噬细胞含量，经α-SMA评价平滑肌细胞含量，经天狼猩红染色评价胶原纤维含量。巨噬细胞增多，平滑肌细胞、胶原纤维减少会提高动脉粥样硬化斑块易损性。模型小鼠的动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞含量（16.55±1.12）显著少于对照组（28.21±2.23），差异有统计学意义（P＜0.05）；
平滑肌细胞（27.26±2.51）显著高于对照组（20.92±1.61），差异有统计学意义（P＜0.05）；
而胶原纤维差异不明显。结果提示，基因敲除后，动脉粥样硬化小鼠的斑块稳定性更高。

2.5 常规喂养的小鼠

常规喂养的小鼠颈动脉血管舒张内径、血管收缩内径、血管壁厚度、血流阻力指数无明显的差异。高脂饲料喂养小鼠的动脉血管舒张内径、血管收缩内径有明显的缩小，血管壁厚度有明显增厚，血流阻力指数有明显升高，表明造模会引起颈动脉血管功能障碍。基因敲除后小鼠和高脂小鼠比较，颈动脉血管舒张内径从（0.43±0.03）mm增大到（0.53±0.01） mm，差异有统计学意义（P＜0.05）；
血管收缩内径从（0.36±0.02）mm 增大到（0.45±0.02）mm，差异有统计学意义（P＜0.05）；
血管壁厚度从（0.012±0.012）mm 减小到（0.085±0.002）mm，差异有统计学意义（P＜0.05）；
血流阻力指数从（0.890±0.012）mm降到（0.760±0.001） mm，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明基因敲除后，能明显改善血管壁增厚及血流阻力情况。

长久以来，研究中针对动脉粥样硬化提出了多种病理相关学说，包括：炎症、损伤反应、内皮功能紊乱、血栓形成等众多学说［3］。目前对动脉粥样硬化病理学特征较统一的看法是胆固醇及急速的血湍流刺激动脉血管造成血管的内皮出现不同程度的损伤，大量的脂蛋白蓄积在内皮下，堆积成了脂纹。外周单核细胞经黏附、分化作用，形成了巨噬细胞，吸收脂蛋白产生了泡沫性细胞。而内皮细胞的活化性及大量细胞生长因子，对平滑肌产生刺激增生，且细胞外基质出现斑块，其内的细胞凋亡坏死［4］。

瞬时受体电位TRP初始应用于1969年Manning对果蝇光转导突变体的研究中，光刺激影响果蝇突变体产生瞬时钙浓度增加，并出现电位反应［5］。其分为7 个亚家族，TRPC 是其中一个类似的蛋白家族，而TRPC 有7 个亚型，TRPC1-TRPC7，每个亚型都有6个跨膜区，5、6跨膜区间有孔环结构，每4个成员可组成同源及异源四聚体，构成TRPC 通道。TRPC1 常表达在哺乳动作组织中；
TRPC2 是人类假基因，表达于大鼠犁鼻器官及小鼠精子头部神经元微绒毛中；
TRPC3表达于脑、卵巢、肺、肠、胎盘及睾丸中；
TRPC5常表达于脑中；
TRPC6多表达在肺中，其次是脑、卵巢、肌肉、胎盘中；
TRPC7 表达在脑、肺、心、眼、睾丸中。TRPC 主要的激活方式有两种，即受体操纵和库操纵钙内流，以引起钙浓度变化。受体操纵中，G蛋白偶联受体及受体酪氨酸激酶受外源性刺激，募集磷脂酶C、水解磷脂酰肌醇、二磷酸，产生肌醇、二酰甘油、三磷酸，经结合后引起钙释放进入胞浆。DA直接激活TRPC引起细胞外钙内流。库操纵钙内流中，细胞内钙库耗竭使内质网膜的STIM1 和细胞膜上Oriall 偶联，激活TRPC 通道，促使外钙出现内流。临床上大多研究均显示，TRPC参与了人体中枢神经系统疾病、呼吸系统疾病及心血管系统疾病等多系统疾病的发生、发展过程。

本文通过对尸检标本进行研究，提示TRPC6参与了动脉粥样硬化的病理过程。有临床研究指出，TRPC-1 及TRPG-6 在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞内有Ca2+升高现象，对肺动脉血管的重建有重要的作用。研究还指出，低氧3 周会增强肺动脉高压的大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC-l、TRPC-6表达，细胞外Ca2+通过TRPC通道使细胞内流增加，升高细胞内的Ca2+［6］。而动脉粥样硬化明显的斑块组织中成分较复杂，包括巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞。其中内皮细胞及平滑肌细胞在动脉粥样硬化发生及发展各阶段均有重要作用。对小鼠建模的进一步研究显示，高脂饲养的小鼠动脉粥样硬化发生及发展迅速，可诱导动脉粥样硬化斑块形成。小鼠的主动脉进行TRPC6免疫组织化学法，发现其动脉粥样硬化斑块中的TRPC6表达上升，与人颈动脉的斑块组织检测结果一致。结果说明，尸检和小鼠组织实验均显示TRPC6参与了动脉粥样硬化的发生发展过程。另外，小鼠基因敲除后，动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞显著减少，平滑肌细胞及胶原纤维明显增多，使其斑块稳定性更高。

内皮细胞是构成血管壁的主要细胞，动脉粥样硬化的发生、发展过程中有血管内皮细胞凋亡的参与。内皮细胞与星形胶质细胞是心血管及中枢神经系统的组成部分，对其生理及病理功能作用较大。血管内皮细胞具体是指血管内膜表面细胞，连续覆盖整个血管腔表面扁平细胞，是功能性界面，处于血液及组织分界面。参与血管收缩、舒张、凝血、血管生成、动脉硬化、炎症的病理过程。有研究显示，TRPC-7 干扰对人脐静脉内皮细胞表达。可增加细胞的繁殖及迁移，对高糖引起的内皮损伤起到了一定保护作用［7］。提示TRPC-7 参与了血管内皮生理及病理过程。内皮细胞不仅能起到机械屏障及信息传递作用，还可合成分泌血脂活性物质以调节血管环境，使其保持稳定的收缩舒张，抑制平滑肌迁移及增生，保持血栓形成及纤溶蛋白溶解平衡。血管内皮细胞受损后，分泌炎性因子，诱导单细胞核黏于表面，浸润到内皮下间隙。延迟的内皮细胞覆盖功能缺失，不仅促成了血管内形成粥样硬化斑块，也是血管不良修复反应的主要原因。部分早期研究中显示，人肺脐动脉、皮肤微血管及大鼠肺动脉内皮细胞中均有TRPC 表达。研究说明TRPC 参与了血管内皮细胞通透性及凋亡过程。血管内皮具有血液流动和溶质经半通透性血管内皮层的调节功能。如血管出现炎症，会诱导内皮细胞形态出现改变及收缩，促使内皮的通透性程度。TRPC本身具有调节钙离子流的作用，对血管内皮细胞通透性产生着影响。人肺动脉内皮细胞经TNF-α处理后，其TRPC表达上调。TNF-α刺激肺动脉、皮肤微血管内皮细胞，能显著加倍提高凝血酶诱导的钙离子内流。同时，肌动蛋白张力丝形成和跨内皮单层电阻也会增加内皮通透性。而皮肤微血管内皮细胞受TNF-α刺激影响TRPC 表达，内皮屏障出现障碍，与TRPC 对钙离子内流调节时影响细胞形态有关。因此，TRPC 的表达水平高低是内皮细胞通透性信号表达的重要影响因素。TRPC 参与内皮细胞凋亡调节，内皮细胞凋亡过大，会影响其生物学功能。NF-KB信号诱导内皮细胞表达，加速炎性、抗凋亡基因， RNA 抑制TRPC 表达，并影响凝血酶诱导钙离子的内流情况，避免激活NF-KB。有研究显示，受TRPC基因干扰后，凝血酶诱导内皮细胞凋亡为25%［8］。且经基因微点阵分析显示，内皮细胞凝血酶诱导表达NF-KB 调节基因呈多倍增加，其中A20抗凋亡基因表达最高。

血管平滑肌细胞是血管重要成分，起着血管活性及构型的重要作用。血管平滑肌细胞增殖对动脉粥样硬化、高血压等血管疾病形成机制有着重要作用。在肺动脉高压患者和动物模型中，其血管平滑肌细胞膜TRPC6表达显著升高，并促进平滑肌细胞膜的增殖及侵袭。提示TRPC6可促进平滑肌细胞膜，对肺动脉高压的发生发展起着重要作用，平滑肌细胞增殖及凋亡出现失衡，细胞基质分泌使细胞、生长因子介导血管的再塑，是造成肺动脉高压的主要原因。增殖和凋亡是相互对立制约的，两者一起维护着机体组织器官各结构的稳定，一旦受多种内外因素影响打破，会引起组织器官的增生、萎缩、重构等病理现象。平滑肌细胞正常状态下是静止的非增殖状态，起着调节血管张力的作用，胞质内有丰富肌丝。血管内皮细胞损伤使胰岛素类生长因子、生长调解素、内皮衍生因子表达激活。上调平滑肌细胞增殖信号，下调抑制增殖信号，使其基因表达改变，改变中膜平滑肌细胞结构和功能，进入内膜发生增殖，分泌细胞外基质，减少胞内肌丝，平滑肌过度增殖，使其增殖与凋亡内在平衡消失，进而刺激动脉收缩及狭窄，引起病理症状。本研究结果显示，基因敲除后小鼠与高脂小鼠比较，颈动脉血管舒张内径、血管收缩内径有明显增大，血管壁厚度和血流阻力指数有明显减小。说明TRPC6 基因敲除后，能明显改善血管壁增厚及血流阻力情况。

综上所述，TRPC6通过内皮细胞和平滑肌细胞增殖参与了动脉粥样硬化的病理发生、发展全过程，是其潜在的干预靶点，可对此进行深入研究。