CircRNA087631在脑出血患者中的表达及与各临床指标之间的关系

贾 琦，盛楠楠，胡玉奇，刘 祺

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000)

出血性脑卒中在全球的死亡率、致残率均占据较高水平，是全世界死亡和残疾的主要原因，严重威胁着人民的健康水平[1-2]。2017年全球疾病负担(GBD)数据显示，脑卒中是造成我国减寿年数(YLL)的第一位病因[3]。据推测，2030 年我国脑血管病事件发生率将较 2010 年升高约 50%[4]。随着社会的发展和医疗水平的不断进步，脑出血的预后有所好转，但仍不理想。脑出血的发生机制复杂，其中包括神经炎性反应、神经元细胞的凋亡等一系列病理生理反应，因此在脑出血后探索神经炎性因子的机制并进行适当干预，可有效提高脑出血的预后。

编码和非编码RNA的转录图谱已被广泛用于脑出血，以获得对复杂疾病途径的新见解，识别生物标志物以更好地诊断和预测准确性[5-6]。因此，对脑出血中这些RNA进行更全面的分析可能有助于建立有效的干预措施，以减轻脑损伤。脑出血后脑损伤的机制复杂多样，主要涉及细胞毒性、兴奋性毒性、氧化应激和炎性反应等，导致神经元、胶质细胞和血管内皮细胞等细胞凋亡或坏死以及存活和增殖，最终影响血脑屏障(BBB)的通透性和完整性[7-8]。血脑屏障功能障碍是脑出血后脑损伤的一个标志[9-10]。这种破坏将促进脑水肿的形成，通过促进白细胞的涌入参与神经炎性反应，并允许潜在的神经活性物质进入血肿周围的大脑，所有这些都可能导致脑损伤。因此，寻找促进脑血管完整性的潜在靶点是治疗脑出血的方法。

环状RNA(CircRNAs)是新近发现的内源性非编码RNA(NcRNAs)，CircRNAs是一组异质性的非编码转录本，在头部3"端和尾部5"端之间具有共价键，形成环状模式，在中枢神经系统中高度保守并大量表达[11-12]。小脑中CircRim2、CircEl2和CircDym的丰富以及皮质中CircPlxnd1的高表达证明了这一点[13]。虽然它们的生理功能还没有完全确定，但在发育中的突触形成过程中，已经在大脑中观察到了几种CircRNAs的表达量变化。而CircRNA087631在出血性脑卒中的表达及作用尚未有研究，因此，本文旨在研究CircRNA087631在脑出血患者中的表达并分析预后及与脑出血之间的关系。

1.1纳入对象：纳入25例石河子大学医学院第一附属医院2020年6月～2021年6月期间住院的脑出血患者，脑出血诊断标准按照1992年版《脑出血的诊断标准》。纳入标准：
CT影像学检查确诊脑出血患者。排除标准：①患有各类癌症患者；
②除外颅脑外伤、颅内占位或感染病变者；
③除外脑梗死后继发出血者；
④有自身免疫性疾病或其他炎性患者；
⑤除外近期服用抗凝药物者。依据病史、检查、检验结果将诊断为脑出血的患者纳入试验组，同期以门诊健康体检者25例作为对照组。本研究通过本院伦理委员会审批，均已签署知情同意书。

1.2材料与方法：收集并分析年龄、体重指数(BMI，kg/m2)、缺乏锻炼等一般基线资料。测定糖化血红蛋白、同型半胱氨酸、白细胞、血红蛋白、血小板、红细胞和中性粒细胞计数等指标。

1.3实时荧光定量PCR：Trizol法提取肝脏组织中总RNA，调平后逆转录成cDNA，条件为：37℃ 2 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃ 保存。将所得cDNA进行实时荧光定量PCR，所用PCR引物序列见表1。扩增条件为:95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，循环次数40次。使用2-△△Ct计算公式得出mRNA的表达量。

表1 PCR引物序列

2.1一般资料比较：
此研究纳入50例研究对象，其中脑出血组25例，正常对照组25例。在脑出血组中，BMI水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
并且具有脑卒中家族史的患者人数明显多于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 组间一般资料比较

2.2组间生化指标比较：与正常对照组相比较，脑出血组中的糖化血红蛋白水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
脑出血组的同型半胱氨酸水平高于正常对照组；
脑出血组白细胞计数高于正常对照组；
脑出血组的血小板计数低于对照组；
差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 组间生化指标之间比较

2.3CircRNA087631在出血性脑卒中的表达：通过对脑出血患者及健康体检者的血液提取血液中总RNA后检测CircRNA的表达发现，与对照组比较，试验组均高表达CircRNA087631，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4CircRNA087631的表达与临床指标之间的关系：通过测定CircRNA的表达与50例患者的临床指标进行分层，发现CircRNA的表达高低与BMI的升高、存在脑卒中家族史、糖化血红蛋白的升高、同型半胱氨酸的升高、血小板的升高、发生脑出血有着密切关系。见表4。

表4 Circ RNA087631的表达与临床指标的关系(n)

2.5CircRNA087631水平与脑卒中患者临床特征相关性分析：Spearman 相关性分析显示，CircRNA087631水平与脑卒中家族史、同型半胱氨酸、出血量、白细胞均呈正相关；
与GCS评分呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 CircRNA087631水平与结直肠癌脑卒中患者临床特征相关性分析

在出血性脑卒中，需要预后性生物标志物以了解脑出血的发展阶段，从而可以制定个体化治疗策略，鉴于此必须确定用于该疾病的廉价且方便的预后生物标志物。既往的研究并未对脑卒中家族史与脑出血的关系得出明确结论。应激性高血糖不利于神经元修复，进一步加重脑损害，脑出血发生时，59%的非糖尿病患者在入院时血糖水平升高，而45%的患者在入院后72 h内血糖水平一直保持升高(应激性高血糖与脑出血患者预后的关系分析)。同型半胱氨酸水平增高是导致脑出血的原因之一[14]。脑出血，血液渗入大脑，小胶质细胞增多并分泌炎性因子，直接干扰血脑屏障功能，加重 ICH 后的炎性反应[15]。GCS评分可以对脑出血患者的预后进行早期预测且评分越低，预后越差。血小板可作为重要的危险因素，对卒中后血栓复发和出血转归进行评价。随着血小板计数水平的减少，出血风险进行性增加[16]。

本研究揭示了脑出血患者与未发生脑出血患者中相比CircRNA的差异性表达及对疾病进展的相关分析。在本文中首次显示了CircRNA在脑出血中的差异性表达，并对CircRNA的表达与脑出血患者的预后相联系。此外本研究表明脑出血后CircRNA表达水平的变化受到多种动态的调节，与体内多种生化指标变化相协调。

脑出血早期的脑活动主要以细胞死亡和局部炎性反应为主，同时伴有血脑屏障破坏并水肿的形成；
对于慢性脑出血后炎性反应几乎全部消失，血脑屏障修复起到了主导作用，包括但不限于神经发生、血管形成和紧密连接组装。但是长期血脑屏障的修复会导致神经退变。因此对于急性或慢性脑出血的治疗方案基本是靶向分子治疗。血脑屏障的破坏在急慢性脑出血神经功能障碍的发生发展中起关键作用。对脑出血患者的基础研究为其复杂的病理生理过程提供了方向，特别是揭示了炎性反应在推动神经元死亡和导致出血后屏障破坏的神经缺陷中的作用。

研究发现CircRNA在脑出血呈现出高表达，提示在脑出血的发展过程中发挥了重要的作用。通过收集脑出血患者基本资料及脑出血后生化指标的变化，发现多种指标的变化与CircRNA的变化相一致。Wang等人发现在235例蛛网膜下腔出血患者的血液中CircAFF1 上调，阐明了CircAFF1/miR-516b/SAV1/YAP1轴在血管内皮功能障碍中的作用及脑出血疾病的潜在早期诊断价值[17]。本文发现在脑出血患者中CircRNA-087631呈现出高表达，且通过对患者基本资料分析发现与正常对照组相比较，血中同型半胱氨酸呈现出高表达，且表达的高低与CircRNA的表达相一致。血同型半胱氨酸的表达高低与H型高血压相关，有研究发现在H型高血压患者血液中存在高表达的同型半胱氨酸，而脑出血的高危因素中就存在高血压，高血压性脑出血广泛存在于脑出血的患者中；
本文又对患者的基本资料进行对比，发现脑出血患者患有高血压的概率为94%；
因此猜想在脑出血的发病过程中CircRNA的激活表达紊乱，导致CircRNA087631表达升高，通过一系列通路的激活使血中同型半胱氨酸的表达升高引起H型高血压导致脑出血。因此研究脑出血中CircRNA的表达对脑出血的治疗及探究机制研究奠定基础。

相关性分析显示，CircRNA087631水平与脑卒中家族史、同型半胱氨酸、出血量、白细胞均呈正相关；
与GCS评分呈负相关。Xie等[18]发现脑外伤后，损伤侧海马区CircRNA差异表达，认为CircRNA变化不仅与脑损伤有关，而且可能与外伤后的神经新生存在某些关系。研究发现初期脑出血导致血液中的谷氨酸进入组织间隙，出血后凝血酶的产生导致Src激酶活化，随着同型半胱氨酸的升高，增加神经元受到兴奋性毒性损伤的风险[19]。Cui等[19]发现脑出血21 d后脑组织中的lncRNA与mRNA呈差异性表达，认为线粒体基质、G蛋白耦联受体活性降低及嗅觉传导受损、炎性反应可能参与脑出血后功能障碍的形成过程调节。

本研究存在一定的局限性，如样本数量小，因此本研究结果可能存在偏差，且部分患者由于死亡，从而缺少远期影像学资料，因此在今后的研究中本课题组将增加样本量，延长观察时间。通过更多的亚组分型，探索出血部位、出血时间、出血影响因素与脑卒中的关系，进一步纳入更多的CircRNA，明确其在出血性卒中中的作用以及是否会出现出血转归，是否可将CircRNA序列作为出血性脑卒中(特别是早期患者) 的常规筛查序列，精准寻找该疾病的高危因素，对患者进行相关预后评估。