金针菇多糖的提取纯化及生物活性研究进展

申鑫玉，黄悦同，阿依江·特列吾汗，郑艳，岳喜庆

沈阳农业大学食品学院（沈阳 110866）

金针菇（Flammulina velutipes）又名朴菇、智力菇、金菇等，是中国和日本最受欢迎的食用菌之一[1]。从历史上看，自公元800年以来，中国一直在种植供食用和药用。如今，金针菇作为膳食补充剂也被广泛应用于一些西方国家。金针菇是一种低热量的食物，不仅味道鲜美且具有很高的营养价值和药用价值，富含多种营养成分，如蛋白质、膳食纤维、维生素、矿物质元素及各种功能因子，这些物质均为人体所必需，长期食用对人体健康有益。

近年来，金针菇中生物活性物质越来越受科研工作者所关注，已成为研究的热点，在功能性食品等方面具有良好的应用前景。在金针菇的子实体中已分离出许多具有生物活性的化合物，如多糖、类黄酮、蛋白质、酚类和倍半萜等。主要生物活性成分之一多糖，被证明具有免疫调节作用、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、改善学习记忆能力、保肝等生物活性作用[2-4]。对近年来国内外金针菇多糖（Flammulina velutipespolysaccharide，FVP）的研究进行整理、归纳和总结，综述金针菇多糖的提取纯化技术、结构解析、生物活性及其作用机理，以期为深入研究多糖的构效关系及更好地发展工业化生产提供一定理论依据。

金针菇多糖的提取率受提取温度、提取时间、料液比、提取次数和初始pH等因素的影响，并且不同的提取方法对多糖得率，以及单糖组成、分子量和结构特征等均有一定影响。传统提取方法存在操作时间长等缺点，为提高提取效率，超声波辅助提取法等一系列方法得到发展。国内外应用的提取方法及优缺点如表1所示。

表1 金针菇多糖的提取方法

1.1 传统提取法

热水提取法是最常见的传统提取方法之一，温度在60～100 ℃，高于或低于最佳温度范围会使提取效率降低。热水提取法得到的多糖主要以β-（1→3），（1→4），（1→6）糖苷键为主链的葡聚糖构成。刘晓敏等[5]通过单因素试验和响应面分析得到金针菇子实体多糖的最佳提取条件：提取温度96 ℃、料液比1∶40、提取时间2.26 h，在此条件下粗多糖得率为3.82%。传统的水提取法所需的高温可能会破坏金针菇中多糖的化学结构，进而影响生物活性。因此，多采用热水提取法与其他方法相结合。

酸碱提取法一般在热水提取法后进行，酸碱提取液可使多糖迅速沉淀，将样品干燥、粉碎，并用1∶15（w/V）的沸水提取2 h，在4 ℃下与等体积的0.8 mol/L三氯乙酸混合3 h，将上清液与95%乙醇混合，最终获得多糖。尽管传统提取方法易于实施，但需要较长的提取时间、大量的溶剂和高温，阻碍其广泛的商业应用。

1.2 超声辅助提取法

超声波在金针菇多糖提取过程中对多糖结构产生空化效应及搅拌作用，空化会导致局部的压力和温度升高，致使细胞破裂，从而促进溶质分子的扩散性、溶解性和运输能力，但多糖的构象不会改变[6]。作用产生的瞬时高压或剪切力可破坏金针菇多糖链的三螺旋结构并降解为分子质量多糖，有效增加多糖的提取率。Zhao等[7]研究发现超声功率680 W、提取时间19.8 min、料液比1∶28时，粗多糖得率为16.20%，提取率远高于传统提取方法。超声辅助提取可能会降解一部分可溶性多糖，但对多糖生物活性的影响并不显著。

1.3 酶辅助提取法

酶可以有效催化金针菇细胞壁基质的水解和降解，从而释放出胞内生物活性物质。常用的酶有纤维素酶、胰蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶。陈贵堂等[8]研究发现，添加木瓜蛋白酶可以显著提高金针菇根部多糖得率，木瓜蛋白酶添加量1.5%、料液比1∶20、酶解pH 5.5、酶解温度52 ℃、酶解时间82 min时多糖提取率为5.90%。此外，多酶水解具有协同作用，有利于打破分子间的物理化学联系，释放出更多的多糖，提高多糖提取率。

1.4 微波辅助提取法

微波加热可对极性分子取向进行转变，使分子发生振动和旋转，细胞中的水分蒸发，从而增加分子间碰撞的频率及温度急剧上升导致内压增加[9]。巨大的压力使细胞破裂，进而使多糖分子释放。张斌等[10]以金针菇废渣为原料，利用微波辅助提取法从中提取多糖，确定料液比1∶26、微波功率640 W、微波时间115 s为最佳提取条件，此条件下多糖得率为7.53%。该方法得到的多糖提取时间较短且提取率高，这可能是由于微波辐射会破坏细胞壁，使得内容物更好地与溶剂接触。

1.5 亚临界水萃取法

亚临界水萃取法也称热压水提取法，是一种在高压下使水在超过沸点的情况下依旧保持液态的新技术。根据使用温度，该方法可以选择性地提取不同种类的化合物，极性较大的化合物在较低的温度下提取，极性较小的化合物在较高的温度下提取。程斌[11]研究表明，亚临界水萃取FVP的最佳提取条件为萃取压力7 MPa、料液比1∶20、提取温度150 ℃、提取时间12 min，在此条件下多糖得率为5.21%。该方法的高温和高压可以提高代谢物的溶解度，但同时会引起多糖结构和构象的变化，导致其应用受到高温高压特性的限制。

1.6 其他提取方法

近年来，对多相提取系统的关注度日益增加，双水相萃取法可以同时提取2种或多种组分多糖，逐渐被应用于小分子的分离纯化[12]。高压脉冲电场提取法是通过变压器将220 V直流电变为上千伏交流电，经过整流变回为高压直流电，该过程可使细胞壁瞬间破裂，导致细胞内容物流出[13]。超临界CO2萃取法是利用温度和压力使超临界CO2与待分离物质接触，使其有选择性地把极性、分子量和沸点不同的成分萃取出来[14]。关于提取金针菇多糖的研究中大多数集中在如何提高提取率上，而多糖的理化性质和化学结构很大程度取决于提取多糖的方式。对于比较提取方法与化学结构和理化性质之间的关系尚且缺乏研究。

金针菇粗多糖通常含有各种杂质，包括蛋白质、色素及小分子物质等，这些杂质会影响多糖的结构和活性。除蛋白的主要方法有Sevage法、三氯乙酸法、蛋白酶水解法和三氟三氯乙烷法。Sevage法是最广泛且经典的除蛋白方法，此方法操作简单、成本低，但需重复多次。三氯乙酸法是将三氯乙酸与蛋白质结合形成不溶性盐从而使蛋白质变性。蛋白酶水解法对多糖的破坏小，但成本较高。三氟三氯乙烷法的去除率较高，但因其具有挥发性，不宜大量使用。

在提取多糖的过程中可能会混入一些酚类物质，导致多糖溶液颜色加深，因此需要除去色素。常用的脱色素方法主要有活性炭吸附法、大孔树脂吸附法和过氧化氢（H2O2）法。活性炭吸附法主要是利用对色素具有吸附作用。该方法操作简单且成本较低，但多糖损失率较大。大孔树脂吸附法是根据其多孔结构对多糖进行脱色。该方法虽脱色率高但成本高，使用率较低。H2O2法是利用H2O2将色素氧化，进而除去色素。H2O2法操作简单、脱色率高且成本低，是除色素中使用率较高的方法。

除去蛋白和色素后，多糖中还会混有一些小分子物质，因此要对多糖溶液进行透析。常用的为半透膜法，根据半透膜孔径大小截留或去除分子量不同的物质。提纯后通常获得的是几种组分形成的多糖混合物，很难同时对多组分多糖进行分析，因此需要对提纯后的多糖进行进一步纯化得到单一组分多糖。可使用超滤、冻融、沉淀或柱层析进一步纯化多糖。在这些纯化方法中，柱层析法使用最多，因其成本低、效率高[22]。柱层析主要有凝胶柱层析、离子交换柱层析和纤维素柱层析。多糖可基于不同的离子性质通过阴离子交换层析分离，并根据不同的分子量通过凝胶过滤层析进一步纯化，并非得到单一组分多糖。

FVP结构较为复杂，但由于多糖的活性可能与其结构相关，因此有必要研究其结构特性。多糖是由一系列单糖通过糖苷键连接而成的，可分为同多糖和杂多糖，FVP大多为杂多糖，除了其单糖单元具有不同类型和顺序外，其在分子量、单糖组成及糖苷键等方面也不同，这导致其结构的多样性[23]。

高效凝胶色谱、高效液相色谱（HPLC）和高效尺寸排阻色谱等分析方法用于测定多糖的分子量。在单糖组成的研究中，通常将FVP进行水解和衍生，通过HPLC、气相色谱-质谱和高效阴离子色谱等进一步分析。甲基化分析及核磁共振光谱可以确定主链和支链的组成。研究FVP的官能团通常采用红外光谱、傅里叶红外光谱和紫外光谱。高碘酸盐氧化、Smith降解及还原裂解通常用于确定糖苷键类型[24]。扫描电镜及原子力显微镜通常用于高级结构的测定。

FVP的单糖组成主要包括葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、岩藻糖（Fuc）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）和木糖（Xyl），分子量范围主要为3.84～2 782 kDa[25]。Smiderle等[26]从金针菇子实体中得到由Glc组成的均一多糖PK2，PK2为支链型β-葡聚糖，主链为（1→3）-Glcp残基，在O-6位点被β-Glcp侧链取代。严茂祥等[27]从金针菇中提取多糖得到3个组分FVP-1、FVP-2、FVP-3，平均分子量依次为10×104，4×104和2×104Da，且3个组分均主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及木糖组成。不同组分多糖的单糖组成、分子量和糖链结构等均会呈现一定差异。

多糖作为金针菇中的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、免疫调节作用、抗肿瘤、改善学习记忆、抗炎症、保肝等生物活性作用，对人体健康十分有益。FVP的生物活性及简单的作用机理如图1所示。越来越多研究发现，FVP可作为改善或减轻症状的膳食补充剂用于对抗疾病[15]。但对生物活性的研究普遍倾向于细胞和动物试验，并且对生物活性的作用机理及构效关系的研究还不够深入。

图1 金针菇多糖的生物活性及作用机理

4.1 抗氧化

活性氧自由基（ROS）在细胞信号传导和生物体内平衡中发挥重要作用。许多疾病都是由自由基引起的，因此具有抗氧化作用的物质可以对此改善和缓解。研究表明，FVP能有效清除自由基，具有显著的抗氧化作用，维持机体氧化代谢产生的ROS在机体内的动态平衡状态以保护细胞免受氧化应激。有研究表明抗氧化性能与FVP的分子量有关。Liu等[18]从金针菇渣中提取多糖，并通过柱层析纯化得到多糖FVRP-1、FVRP-2、FVRP-3，平均分子量分别为29 930，62 290和36 310 Da，三者均具有较强的抗氧化性，其顺序为FVRP-1＜FVRP-3＜FVRP-2。且金针菇酸性多糖的清除自由基活性高于中性多糖。这是因为酸性多糖是由糖醛酸组成的复杂酸性碳水化合物。糖醛酸可以改变碳水化合物的理化性质和溶解性，从而增强多糖的抗氧化活性。

4.2 免疫调节作用

FVP主要通过激活巨噬细胞、B细胞、T细胞和NK细胞，加速脾细胞增殖来增加抗体的分泌，同时还能增加B细胞分泌的IgG和IgM的水平，从而达到免疫调节的功能。多糖中的β-葡聚糖与dectin-1受体结合后出现在不同的细胞上，包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和中性粒细胞产生信号传导，导致触发丝裂原活化蛋白激酶，进而产生细胞因子，促进免疫反应[28]。Liang等[29]采用蛋白质组学和肠道菌群学研究FVP对免疫抑制小鼠的调节作用机制，结果表明FVP通过参与转运与分解代谢、吞噬体等信号通路调节免疫蛋白，增加肠道菌群丰度，调节肠道菌群平衡，从而发挥免疫调节作用。此外，多糖的免疫活性与其主链结构和构象有关。不同的食用菌多糖具有不同的化学成分，其中大多数以β-葡聚糖为主，在葡聚糖主链上以β-（1-3）-Glc作为主要的连接方式。高分子量的葡聚糖比低分子量的葡聚糖更有效。Chen等[6]研究超声辅助提取法和热水提取法提取的2种金针菇多糖FVPU和FVPH对免疫调节活性的影响，研究表明，两者均可增强A型巨噬细胞的吞噬活性，但最高浓度50 μg/mL时，FVPH的激活作用优于FVPU，这可能由于FVPU的三螺旋结构被破坏。由此可见，FVP的三螺旋结构在免疫调节中起着重要作用。FVP有助于机体提高免疫力，不仅可作调节肠道微生物群的益生元剂，还具有作为功能性食品或免疫调节剂的潜能。

4.3 抗肿瘤

FVP主要通过清除自由基和增强细胞的免疫调节功能从而间接抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡或转移。1982年，Ikekawa等[30]从金针菇中提取、分离纯化后得到的多糖，首次通过分析发现分子结构和抗肿瘤活性之间的关系，即分子量大的多糖具有更高的抗肿瘤活性。Yang等[31]从金针菇中分离得到2种纯化多糖FVP-1和FVP-2，研究其对人胃癌BGC-823细胞和肺癌A549细胞的体外抗增殖作用，结果显示两者均能显著抑制BGC-823细胞的增殖，且呈浓度依赖性。这种高抗增殖活性可能是由于多糖的结构特征，以及生物系统对多糖的三重螺旋结构的识别。多糖组分能显著提高巨噬细胞的增殖和吞噬活性，并对癌细胞有抑制作用。FVP具有良好的抗肿瘤活性，具有开发抗癌药品的潜力。但癌症至今仍是尚未解决的致命疾病之一，世界公共卫生仍面临巨大挑战。

4.4 改善学习记忆能力

金针菇经常被称为“智力菇”。其记忆功能可能与脑组织中的乙酰胆碱（ACh）、5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质有关。胆碱能系统涉及广泛的大脑功能，影响突触可塑性和认知能力。胆碱乙酰转移酶负责将细胞质中的乙酰辅酶A和胆碱合成ACh，泡状乙酰胆碱转运体将神经递质摄取到突触泡中。乙酰胆碱酯酶活性升高会使突触间隙中的ACh含量下降，从而导致学习记忆能力下降。一项研究[32]采用Morris水迷宫法和大鼠脑生化分析方法，探究FVP对东莨菪碱诱导的学习记忆障碍的影响，结果表明FVP显著降低隐藏平台试验大鼠的逃避潜伏期和总游泳距离，增加大鼠的过平台次数。生化检查显示，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及ACh等神经递质水平显著提高。此外，FVP可激活与学习记忆相关的信号通路，提高connexin36和p-CaMKII的表达。研究结果表明FVP对学习记忆能力有一定促进作用，为使用FVP作为一种安全有效的药物预防和治疗阿尔茨海默病提供科学证据，但对于多糖改善学习记忆能力在信号通路调节机制的研究还不够深入。

4.5 抗炎活性

炎症是组织防御各种损伤因子的刺激所发生的基本病理过程，是一种自我保护机制。FVP具有潜在的抗炎活性，通过调节肠道微生物可以增加有益菌从而减少炎症，其抗炎活性主要基于免疫调节作用[25]。Zhang等[33]以右旋糖酐硫酸钠诱导大鼠结肠炎为试验对象，FVP治疗可调节结肠微生物菌群失调，促进盲肠短脂肪链水平的增加，导致TLR4/NF-kappa B信号通路下调，最终结肠中炎症因子明显降低，改善结肠炎。FVP具有作为功能性食品成分或预防结肠炎药物的潜力。

4.6 保肝活性

FVP可以通过阻止丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的释放以减少肝细胞的凋亡，抑制脂质过氧化反应，从而保护肝细胞免受四氯化碳（CCl4）代谢物的损伤及破坏蛋白合成带来的损伤。Zhang等[34]研究发现金针菇水溶性多糖可降低乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和乙型肝炎病毒的DNA复制表达，表现出显著的乙肝表面抗体活性，起到保护肝脏受损的作用。此外，FVP还可以提高肝脏中SOD和GSH-Px活性，增强肝脏自由基的清除能力，从而减少对肝细胞的损害作用。由此可见FVP在保肝活性方面具有很大的发展前景，但研究仍处于比较基础的层面，还需深入研究。

4.7 其他生物活性

FVP除具有上述生物活性外，还具有降血糖、降血脂、抗疲劳等生物活性。FVP具有促进机体胰岛素分泌，改善胰岛素敏感性和修复受损胰岛细胞的作用[35]。Yeh等[36]研究表明添加3%的金针菇提取物对高脂饮食诱导的血清高密度脂蛋白胆固醇水平升高的仓鼠脂质代谢有显著影响。Su等[37]评价金针菇等4种食用菌多糖对小鼠的抗缺氧和抗疲劳作用。研究表明，FVP可提高负重游泳能力、缺氧生存时间、肝和肌糖原含量、红细胞比容和血红蛋白水平，降低血清尿素氮和血乳酸水平，调节机体的自我代谢和恢复能力，具有缓解运动疲劳、补充体力和促进恢复运动疲劳的作用。

近年来，食用菌多糖成为研究热点。我国金针菇资源较为丰富，为FVP的研究提供得天独厚的资源优势。传统的多糖提取、分离纯化方法及近些年发展起来的新兴方法都各有优缺点，因此有必要找到最适合金针菇的方法，从而使其发挥良好的生物活性。也可将2种或2种以上方法结合使用，旨在提高多糖提取率的同时降低成本。

多糖结构的分析现在仍然面临巨大挑战。由于不同提取纯化技术分离的多糖结构特征不同，其生物活性也有一定差异。科研工作者可以进一步尝试研究金针菇多糖的主体结构和高级结构，还可以使用3D和其他新兴技术来修饰多糖的结构，从而增强生物活性。只有更准确地了解具体结构，才能进一步探索多糖的分子结构与生物活性之间的关系，并扩大其在医药、保健品和化妆品中的应用。由于多糖的生物活性与其结构密切相关，因此研究活性多糖的结构和功效对改善多糖的性能和未来药物的开发具有重要意义。此外，有些金针菇多糖是以糖蛋白的形式发挥生物活性，需要深入研究。

未来的研究可能有几点：（1）从金针菇菌丝体中提取多糖，比栽培金针菇子实体大幅缩短用时，提高生产效率，更有利于工业化生产。将菌丝体与子实体多糖的结构、生物活性进行对比分析，建立优良的构效关系。（2）许多试验证明金针菇具有一定生物活性，但有些活性的作用机制尚未研究清晰，还需进一步研究。（3）深入研究金针菇多糖在膳食补充剂生产中的应用。这种资源的开发和利用将会促进工业和医药等许多领域的发展。