βGlcY染色技术在枣果实阿拉伯半乳糖蛋白组化定位中的应用

章英才， 王 静， 陶珊珊

(宁夏大学 生命科学学院， 银川 750021)

阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins，AGPs)是一类结构复杂的大分子，广泛分布于植物体各器官的细胞中，参与植物营养生长[1]、生殖生长和发育[2]的各个环节。目前集中研究AGPs在根形态建成、细胞增殖与程序性死亡、雌雄配子体的发育、花药发育与花粉管生长、体细胞胚胎发生以及植物激素信号传导等方面的功能[3-4]，但对植物果实发育中AGPs的研究较少，如苹果[5]、宁夏枸杞[6-7]等果实。AGPs由多糖支链和蛋白质核心链组成[8-10]，糖基部分主要由阿拉伯糖和半乳糖构成[11]。研究表明，宁夏枸杞多糖是一种以-O-连接的糖和蛋白质结合的阿拉伯半乳聚糖AGPs糖蛋白，枸杞果实的多糖具有典型的AGPs阿拉伯半乳聚糖糖蛋白特征，分布于果肉细胞的细胞壁、细胞膜和质体膜[6-7]；
枸杞多糖是type II类型的阿拉伯半乳聚糖蛋白AGPs[12]。枸杞子糖蛋白被证实是枸杞果实提高免疫活性和抗衰老的药用有效成分[13-14]。这与已报道的长枣多糖的药理功能相一致[15]，也与灵武长枣不同发育时期果实中精制多糖的10种单糖中阿拉伯糖、半乳糖含量较高的研究结果一致[16]。因此，明确灵武长枣果实AGPs多糖蛋白积累和分布非常重要。

AGPs可能分布在植物各种组织和细胞的细胞壁、质膜、细胞器以及胞外基质等部位[17]。人工合成的苯基偶氮染色剂βGlcY(β-D-glucosyl-Yariv reagent)与AGPs发生特有反应，形成棕红色絮状沉淀，成为鉴定AGPs的常用染色剂[9]。但更多的是利用βGlcY对组织和器官中AGPs进行定量分析[17-18]，以及通过与AGPs结合研究其功能[18-19]，而利用βGlcY进行定位分布的研究极少[17]。与AGPs进行特异性反应的单克隆或多克隆抗体，成为研究AGPs时空分布普遍采用的良好工具[20-21]。如Bao等[7]通过Western Blot分析证实JIM8、JIM13、MAC204、JIM94为抗枸杞果实AGPs的抗体，并对果实AGPs进行了免疫组化定位。目前，通过βGlcY试剂对AGPs染色、单克隆抗体与AGPs反应等手段，为不同植物中不同部位AGPs的分布和表达定位提供支撑[22-25]。

灵武长枣(ZiziphusjujubaMill cv. Lingwuchangzao)原产于宁夏灵武市，果实中长枣多糖蛋白是最重要的药用生物活性成分之一。近年来，在灵武长枣果实贮藏保鲜、品种选育等方面有了较多的研究成果[26]，而有关果实多糖重要组成AGPs糖蛋白的分布和与果实品质影响的研究尚未见报道。因此，本研究以不同发育时期的“灵武长枣”果实为试验材料，应用βGlcY染色技术，研究了不同发育时期果实AGPs的分布特征，并通过免疫荧光定位法进行印证。为探讨AGPs定位分布研究的βGlcY染色技术及该成分在品质调控方面的功能奠定基础。

1.1 材料

以位于宁夏灵武市的宁夏红枣工程技术研究中心试验基地6年生“灵武长枣”为供试材料，采用随机设计，3次重复，分别在果实膨大前期(2021年7月10日)、快速膨大期(2021年8月9日)、着色期(2021年9月8日)、完熟期(2021年9月28日)，选择标记3 000朵花朵的枝条上果实作为试验对象，采摘后用冰壶冷藏带回实验室[27]。

按质量比为9∶1称取聚乙二醇-400二硬脂酸酯[Polyethylene glycol (PEG) 400 distearate(Sigma-Aldrich，cat.#305413)]和1-十六烷醇[1-Hexadecanol (Sigma-Aldrich，cat.#258741)]颗粒，放入烧杯中在50 ℃的温箱中熔化混匀，室温下冷却成为熔点35 ℃～37 ℃石蜡Steedman’s wax保存备用。βGlcY和βManY购自Biosupplies Australia Pty Ltd；
AGPs单克隆抗体MAC204购自美国乔治亚大学，碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 糖蛋白βGlcY定位

(1)石蜡切片。选取各不同发育时期的果实，用刀片将材料切成带外果皮的(0.6×0.4×0.5) cm小块，立即放入4%多聚甲醛-0.5%戊二醛的PBS(10 mmol/L，pH 7.4)固定液中，盖紧瓶盖后注射器多次抽气至样品沉落瓶底，在室温下固定12 h或过夜。样品用PBS磷酸缓冲液(10 mmol/L，pH 7.4)清洗3次，每次15 min。在4 ℃下依次用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脱水，每次60 min，100%乙醇3～4次，60 min /次。样品在37 ℃恒温箱中用1∶1的纯乙醇∶Steedman’s wax石蜡渗透过夜，次日更换1∶3的纯乙醇∶石蜡渗透2.5 h，再用纯石蜡继续渗透3次，每次2 h。将样品用纯石蜡在牛皮纸盒中包埋，常温凝固后即可。将样品蜡块固着在小木块上，在25 ℃左右环境中，用LEICA RM 2255切片机切片，厚度为10 μm，光面朝下放在较低温的瓷盘中。先在涂有0.2%聚乙烯亚胺的载玻片上加一两滴蒸馏水，用镊子将蜡带光滑面朝下轻放在载玻片水滴中，按顺序排好，在25 ℃左右室温下可自然展片，切片自然展片后将多余的水吸去，晾干一周后备用。(2)βGlcY和βManY标记。将粘有蜡带的载玻片切片放入装有纯乙醇的染色缸中，中间换2次纯乙醇，30 min/次，切片完全脱蜡后，依次放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇的染色缸中逐级复水，每级10 min。直接在载玻片上滴1滴配置好的0.05、0.1、0.5、1 mg/mL的Yariv reagent(用预先配制1 mg/mL溶解于0.15 mol/L的NaCl母液稀释)对切片染色60 min。对照采用βManY(用预先配制1 mg/mL溶解于0.15 mol/L的NaCl母液稀释)，即阴性对照切片用βManY代替βGlcY；
然后用ddH2O冲洗2～3次，每次1 min。稍微晾干后，取100%甘油少许滴在切片上封片。吸去多余的封片剂后用指甲油将盖玻片周围封固，OLYMPUS IX73显微镜下观察拍照。

1.2.2 糖蛋白免疫荧光定位

参照Bao等[7]的方法，略有改动。(1)石蜡切片。4个发育时期果实用刀片切成合适的大小，立即放入含有体积分数为3.7%的甲醛的2F4固定液中，盖紧瓶盖后注射器抽气至样品下沉瓶底，室温固定4 h。更换固定液3次，每次30 min。然后用PBS磷酸缓冲液(10 mmol/L，pH 7.0)清洗3次，每次15 min。样品在4 ℃下用0.05% Toluidine blue(甲苯铵蓝)染色15 min，在4 ℃下依次用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脱水，每次60 min，100%乙醇3～4次，60 min/次。样品用纯乙醇∶Steedman’s wax石蜡=1∶1在37 ℃恒温箱中渗透过夜，次日更换纯乙醇∶石蜡=1∶3渗透2.5 h，再用纯石蜡在37 ℃渗透3次，每次2 h。将样品用纯Steedman’s wax在牛皮纸盒中包埋，常温凝固即可。后期蜡块的固着、整修、切片、贴片和展片与前述石蜡切片步骤相同。(2)免疫荧光标记。将贴片后的载玻片放入装有纯乙醇的染色缸中，中间换2次纯乙醇，30 min/次，切片即可全部脱蜡。切片依次放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇的染色缸中逐级复水，每级10 min。将载玻片上切片在PBS(10 mmol/L，pH 7.4)培养皿中浸泡10 min，用含50 mmol/L甘氨酸的PBS溶液封闭30 min，PBS(10 mmol/L，pH 7.4)浸泡10 min，然后用2% BSA的PBS(10 mmol/L，pH 7.4)溶液室温封闭10 min，PBS(10 mmol/L，pH 7.4)浸泡10 min。用PBS(含1% BSA)以1∶100比例稀释后的AGPs单克隆抗体MAC204，4 ℃下孵育过夜(阴性对照切片采用含1% BSA的PBS溶液代替一抗孵育)，次日用PBS淋洗浸泡3次，每次10 min，以去除多余抗体，再用PBS(含1%BSA)以1∶200比例稀释后的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗36 ℃黑暗条件下孵育1 h。标记后，PBS淋洗浸泡3次，每次10 min，除去未标记的二抗，用0.01% Toluidine blue染色10 min，以去除植物本身的自发荧光。切片用PBS(10 mmol/L，pH 7.4)淋洗(浸泡)10 min，稍微晾干后，取甘油少许滴在切片上，用盖玻片封片，避免产生气泡，吸去多余的封片剂后用指甲油将盖玻片周围封固，尽快在OLYMPUS IX73荧光显微镜下观察并拍照。

2.1 膨大前期果实AGPs的βGlcY定位

βGlcY与AGPs发生特有的反应，形成棕红色絮状沉淀。膨大前期果实0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同浓度的βGlcY形成的棕红色沉淀的强弱不同，浓度越高染色强度越大[图1(a)～(d)]。而βManY在果实相应部位均没有棕红色沉淀[图1(e)]。果实外果皮βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光在细胞壁和细胞内部均有分布，紧邻外果皮的数层排列较为紧密，内部相邻数层排列较疏松的大型中果皮细胞内外均分布βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光[图1(a)～(d)，(f)～(h)]。维管束所有细胞的细胞壁和细胞内部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光[图1(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分别为0.05、0.1、0.5、1 mg/mL浓度βGlcY处理后AGPs的染色情况；
外果皮及内部组织AGPs定位。(e)近内果皮的中果皮维管束及周围组织，βManY处理后均没有棕红色沉淀。(f)外果皮及内部组织免疫荧光分布。(g)中部中果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。(h)近内果皮的中果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。A：AGPs形成的棕红色沉淀；
VB：维管束；
Ex：外果皮；
En：内果皮。(a)～(f)，Bar=100 μm；
(g)～(h)，Bar=50 μm。图1 膨大前期果实AGPs的βGlcY及免疫荧光定位Figure 1 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the early bulking period

2.2 快速膨大期果实AGPs的βGlcY定位

快速膨大期果实0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同浓度βGlcY形成的棕红色沉淀的强弱不同，浓度越高染色强度越大[图2(a)～(d)]。而βManY在维管束及薄壁细胞等部位均没有棕红色沉淀[图2(e)]。外果皮及内部数层排列较为紧密的中果皮小细胞细胞壁和细胞内部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光；
内部数层大型卵圆形薄壁细胞AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光均主要分布于细胞壁上，大部分细胞内部无分布[图2(a)～(d)，(f)～(h)]。维管束的所有细胞内外均分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光；
除了空腔之外，维管束周围中果皮薄壁细胞的细胞壁都分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光，细胞内部分布较少，部分细胞出现破裂现象[图2(a)～(d)，(f)～(h)]。近内果皮维管束的所有细胞内外以及维管束周围薄壁细胞的部分细胞内外也都分布βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光[图2(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分别为0.05、0.1、0.5、1 mg/mL浓度βGlcY处理后AGPs的染色情况；
中果皮维管束及周围组织AGPs定位。(e)中果皮维管束及周围组织，βManY处理后均没有棕红色沉淀。(f)外果皮及内部组织免疫荧光分布。(g)近外果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。(h)近内果皮的中果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。A：AGPs形成的棕红色沉淀；
VB：维管束；
Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。图2 快速膨大期果实AGPs的βGlcY及免疫荧光定位Figure 2 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the rapid enlargement period

2.3 着色期果实AGPs的βGlcY定位

着色期果实0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同浓度的βGlcY形成棕红色沉淀的强弱也不同，浓度越高染色强度越大[图3(a)～(d)]。βManY在维管束及薄壁细胞等部位均没有棕红色沉淀[图3(e)]。βGlcY-AGPs形成棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光在外果皮及内部数层排列较为紧密的中果皮小细胞细胞壁和细胞内部均有分布[图3(a)～(d)，(f)～(h)]。内部数层大型卵圆形薄壁细胞βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光均主要在薄壁细胞的细胞壁上，而细胞内部均较少分布，分布有所减少[图3(a)～(d)，(f)～(h)]。维管束的所有细胞均分布有AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光；
维管束周围薄壁细胞的细胞壁均分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光，但大部分薄壁细胞内部无分布[图3(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分别为0.05、0.1、0.5、1 mg/mL浓度βGlcY处理后AGPs的染色情况。(a)(d)外果皮及内部组织AGPs定位；
(b)(c)中果皮维管束及周围组织AGPs定位。(e)中果皮维管束及周围组织，βManY处理后均没有棕红色沉淀。(f)外果皮及内部组织免疫荧光分布。(g)近外果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。(h)近内果皮的中果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。A：AGPs形成的棕红色沉淀；
VB：维管束；
Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。图3 着色期果实AGPs的βGlcY及免疫荧光定位Figure 3 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the the coloring period

2.4 完熟期果实AGPs的βGlcY定位

与着色期相似，完熟期果实0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同浓度βGlcY形成的棕红色沉淀的强弱也不同，浓度越高染色强度越大[图4(a)～(d)]。与前几个时期相似，βManY在维管束及薄壁细胞等部位均没有棕红色沉淀[图4(e)]。外果皮及内部数层排列较为紧密的中果皮小细胞的细胞壁和细胞内部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光；
相邻内部较大型的中果皮薄壁细胞βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光均主要在薄壁细胞的细胞壁上，而细胞内部均较少分布，分布明显减少，很多细胞出现破裂[图4(a)～(d)，(f)～(h)]。除空腔之外，在中果皮中部及内部维管束的所有细胞均分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光[图4(a)～(d)，(f)～(h)]。维管束周围薄壁细胞的细胞壁均分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀和抗体所识别的抗原绿色荧光，但大部分薄壁细胞内部无分布[图4(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分别为0.05、0.1、0.5、1 mg/mL浓度βGlcY处理后AGPs的染色情况。(a)外果皮及内部组织AGPs定位；
(b)～(d)中果皮维管束及周围组织AGPs定位。(e)中果皮维管束及周围组织，βManY处理后均没有棕红色沉淀。(f)外果皮及内部组织免疫荧光分布。(g)近外果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。(h)近内果皮的中果皮维管束及周围组织免疫荧光分布。A：AGPs形成的棕红色沉淀；
VB：维管束；
Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。图4 完熟期果实AGPs的βGlcY及免疫荧光定位Figure 4 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the maturation period

总体来看，βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀在各时期果实外果皮及相邻内部数层排列紧密的中果皮小细胞的细胞壁和细胞内部均有分布；
中果皮大型卵圆形薄壁细胞的细胞壁和细胞内在膨大前期均有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀，而在快速膨大期、着色期和完熟期均主要分布于薄壁细胞的细胞壁上，大部分细胞内部无分布；
各时期果实维管束所有细胞的细胞壁和细胞内部都分布有βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀。随着果实发育成熟，βGlcY-AGPs形成的棕红色沉淀分布有所减少。