非小细胞肺癌FOXP3与P53突变的关联及其对Cyclin,D1和CDK4的表达调控作用

历 春，何程远，赵 颖，杨红宇

(1.北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013；
2.吉林化学工业公司总医院，吉林 吉林 132021)

叉头蛋白3(forkhead box protein 3，FOXP3)作为叉头/翼状螺旋转录因子家族的成员之一，不仅在CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)的发育和功能中发挥重要作用，而且还在肺癌、肝癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞中有表达，其通过促瘤或抑瘤作用影响肿瘤的发生和发展[1-5].本课题组前期研究[6-8]发现，FOXP3在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)细胞中高表达，可通过促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移和化疗耐药等促进NSCLC的恶性进展.P53基因是重要的抑癌基因，可通过促进细胞周期阻滞、细胞凋亡和DNA修复等机制防止细胞癌变，至少50%的恶性肿瘤可检测到P53基因突变[9].NSCLC患者组织标本中可检测到约60%的P53基因突变，与肿瘤转移和不良预后关系密切[10-11].目前，NSCLC中FOXP3与P53突变的关联尚不明确.因此，本研究通过分析NSCLC组织中FOXP3和突变型P53(mutant P53，mt-P53)蛋白表达的相关性，观察FOXP3沉默对A549细胞增殖、细胞周期、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)表达的影响，为FOXP3促进NSCLC的发生发展提供新的理论机制，也为NSCLC的免疫治疗提供新的靶点.

1.1 实验试剂

DMEM高糖培养基(上海中乔新舟生物科技有限公司)；
胎牛血清(天杭生物科技股份有限公司)；
FOXP3 siRNA及阴性对照序列(广州锐博生物技术有限公司)；
FOXP3抗体(Abcame公司，美国)；
mt-P53抗体和免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；
LipofectaminTM2000试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)；
SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)；
Cyclin D1、CDK4和GAPDH抗体(成都正能生物技术有限责任公司)；
细胞周期试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；
BCA试剂盒、MTT试剂盒、ECL发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司).

1.2 临床标本资料

收集吉林化学工业公司总医院病理科2010年—2013年原发性非小细胞肺癌(NSCLC)术后标本50例，其中，男30例，女20例；
年龄39～77岁，平均(58.5±9.5) 岁.患者术前均未行放、化疗，术后均有病理学明确诊断.

1.3 免疫组化染色及结果判断

免疫组织化学染色采用PV二步法，参照试剂盒说明书进行，PBS替代一抗作阴性对照.结果判断采用双盲法，以肿瘤细胞质和细胞核显示棕黄色颗粒为阳性染色.FOXP3染色结果分析依照文献[7]、mt-P53染色结果判定依照文献[12]进行.

1.4 细胞培养

人NSCLC细胞株A549由北华大学基础医学院实验室保存，细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2的孵箱中培养.

1.5 siRNA瞬时转染

取第三代A549细胞(3.0×105个/孔)接种6孔板，待细胞贴壁后进行siRNA转染.实验分为A549组、Control-siRNA组、FOXP3-siRNA组.si-FOXP3干扰序列：5′-CAUGGACUACUUCAAGUUCd TdT-3′.转染步骤按照LipofectamineTM2000说明书进行，转染后6 h更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基.

1.6 Real-time PCR

应用0.25%胰酶消化转染各组A549细胞48 h，提取细胞总RNA，反转录为cDNA，使用 SYBR Premix Ex TaqTMII进行FOXP3 mRNA的表达检测.FOXP3 引物F：5′-CAC AAC ATG CGA CCC CTT TCA CC-3′，R：5′-AGG TTG TGG CGG ATG GCG TTC TTC-3′；
GAPDH 引物F：5′-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3′，R：5′-GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATA TC-3′.反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s退火，40个循环.以 GAPDH 为内参，通过 2-ΔΔCt计算方法分析各样本中FOXP3 mRNA的相对含量.

1.7 Western blotting检测蛋白表达

收集转染72 h的各组A549细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定细胞总蛋白浓度.蛋白上样量30 μg，10%SDS-PAGE电泳，并用湿转方式移至PVDF膜上，封闭液封闭1 h，分别孵育FOXP3(1∶500稀释)、Cyclin D1﹑CDK4和GAPDH抗体(1∶1 000稀释)；
4 ℃摇床过夜.次日TBST洗涤3次，加入HRP 标记的IgG抗体(1∶3 000)室温孵育1 h，加入ECL显色底物发光并拍照.以GAPDH作内参，以目标条带与内参条带的灰度值之比作为目标蛋白的相对表达量.

1.8 CCK-8方法检测细胞增殖

将转染24 h后的各组A549细胞以5×103个/孔接种96孔板中，每组5个复孔；
于48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h；
应用酶标仪在450 nm波长检测各孔光密度值(OD值).

1.9 流式细胞术检测细胞周期

应用0.25%胰酶消化转染各组A549细胞48 h，计数1×106/mL；
PBS洗涤细胞1次，加入70% 冷乙醇500 μL，4 ℃固定过夜；
PBS洗涤2次，加入100 μL RNaseA 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染液，室温避光孵育30 min后上机检测.

1.10 统计学分析

2.1 FOXP3和mt-P53蛋白在NSCLC组织表达的相关性

应用免疫组化方法检测FOXP3和mt-P53蛋白在NSCLC组织的表达，Pearson相关分析二者间的相关性.结果显示：FOXP3蛋白的阳性表达率为64.0%，mt-P53蛋白的阳性表达率为56.0%，32例FOXP3阳性病例中P53突变率为68.8%，28例mt-P53阳性标本中FOXP3的阳性表达率为78.6%，Pearson相关分析显示二者之间表达呈显著正相关关系(r=0.342，P=0.015).见表1和图1.

表1 FOXP3和mt-P53在NSCLC组织表达的相关性Tab.1 Correlation between FOXP3 and mt-P53 expression in NSCLC tissues

图1FOXP3和mt-P53蛋白在同一NSCLC 组织中的表达(× 200)

2.2 A549细胞FOXP3沉默效果检测

应用Real-time PCR和Western blotting法检测A549细胞瞬时转染FOXP3 siRNA和Control siRNA沉默效果，结果显示：与A549组和Control-siRNA组相比，FOXP3-siRNA组FOXP3 mRNA和蛋白的表达水平显著下调.见图2.

a Real-time PCR检测FOXP3沉默效果(**.P<0.01) b Western blotting检测FOXP3沉默效果(**.P<0.01)图2A549细胞FOXP3沉默效果检测Fig.2Detection of FOXP3 silencing effect in A549 cells

2.3 FOXP3沉默对A549细胞增殖能力的影响

应用CCK-8方法检测FOXP3沉默后A549细胞的增殖能力，结果显示：与A549组和Control-siRNA组相比，FOXP3-siRNA组细胞的增殖能力显著降低(P<0.01).见图3.

**.P<0.01.图3FOXP3沉默对A549细胞增殖的影响Fig.3Effects of silencing FOXP3 on the proliferation of A549 cell

2.4 FOXP3沉默对A549周期的影响

应用流式细胞术检测FOXP3沉默后A549细胞周

期的变化，结果显示：FOXP3沉默后可诱导细胞发生G0/G1期阻滞，G0/G1期细胞百分率明显上升，与A549组和Control-siRNA组比较差异具有统计学意义(P<0.05).见图4.

*.P<0.05.图4FOXP3沉默对A549细胞周期的影响Fig.4Effects of silencing FOXP3 on the cell cycle of A549 cells

2.5 FOXP3沉默对Cyclin D1和CDK4蛋白表达的影响

应用Western blotting检测FOXP3沉默对Cyclin D1和CDK4蛋白表达的影响，结果显示：随着FOXP3蛋白的表达下调，Cyclin D1和CDK4蛋白的表达也显著下调，与A549组和Control-siRNA组比较差异具有统计学意义(P<0.01).见图5.

图5FOXP3沉默对A549细胞周期蛋白表达的影响Fig.5Effects of silencing FOXP3 on the cell cycle proteins of A549 cells

本课题组前期研究[7-8]发现，FOXP3在NSCLC组织和细胞高表达，其表达与淋巴结转移和临床分期呈显著正相关关系，可通过上皮间质转化促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，还可促进肿瘤细胞对化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶的耐药性.此外，FOXP3表达与Ki-67呈显著正相关关系，可促进NSCLC细胞的恶性增殖，但其作用机制尚未完全阐明.

P53基因突变与肿瘤的发生发展关系密切，约60%的NSCLC患者组织标本中可检测到P53基因的突变，其与肿瘤转移和不良预后显著相关，也是预测NSCLC转移和预后的重要指标[10-11].有研究[13]报道，FOXP3在食管鳞癌中发挥抑瘤作用，其表达与P53突变呈显著负相关关系，而FOXP3和P53突变在NSCLC中的相关性研究尚未见报道.因此，本研究采用免疫组化方法检测了FOXP3和mt-P53蛋白在NSCLC组织中的表达.结果发现，FOXP3和mt-P53蛋白在NSCLC组织高表达，阳性表达率分别为64.0%和56.0%，此结果与前面学者报道[13]基本相符，证实了二者的异常表达与NSCLC的发生发展有关.进一步研究发现，FOXP3阳性病例中P53突变率为68.8%，mt-P53阳性病例中FOXP3的阳性率为78.6%，Pearson相关分析显示二者表达呈显著正相关关系，表明FOXP3在NSCLC的促瘤作用可能与P53基因突变有着密切联系.

有研究[14]表明，P53基因突变后失去对细胞周期的正常调控，导致细胞生长失去控制，进而导致肿瘤侵袭性增强.因此，本研究推测FOXP3可能通过调控细胞周期促进NSCLC细胞的恶性增殖.为验证此假说，本研究采用siRNA干扰技术将FOXP3 siRNA转染到NSCLC细胞株A549细胞中，检测FOXP3沉默后的A549细胞增殖情况及细胞周期的变化.结果发现，A549细胞转染FOXP3 siRNA后FOXP3表达显著下调，A549细胞的增殖受到显著抑制，细胞周期阻滞于G0/G1期，表明FOXP3沉默可通过调控细胞周期而抑制NSCLC细胞的增殖.

Cyclin D1是细胞周期蛋白家族的重要成员，主要在调控细胞周期的G1期中发挥作用[15].Cyclin D1与CDK4结合形成Cyclin D1/CDK4复合物，能够调控细胞由G1期进入S期，促进细胞的增殖和分裂[16].Cyclin D1与CDK4的异常表达可导致细胞周期失去控制，且与NSCLC等多种肿瘤的发生发展及预后密切相关[17-18].因此，为探究FOXP3沉默诱发A549细胞阻滞于G0/G1期的相关机制，本研究进一步检测了FOXP3沉默后Cyclin D1和CDK4蛋白的表达变化.结果发现，FOXP3表达下调后，Cyclin D1和CDK4蛋白的表达水平也显著下调，提示FOXP3沉默后能够抑制NSCLC细胞增殖的机制可能是通过下调Cyclin D1和CDK4的表达实现的.

综上，NSCLC组织中FOXP3的表达与P53突变显著相关，NSCLC细胞中FOXP3沉默可下调Cyclin D1和CDK4表达，诱发细胞周期G0/G1期阻滞，从而抑制NSCLC细胞的增殖.