基于“LncRNA,MALAT1-巨噬细胞焦亡”新视角探讨加味四妙勇安汤促进大鼠糖尿病足溃疡愈合机制

王庆美， 徐鹏， 付媛媛， 潘银燕

（1.山东省立第三医院，山东济南 250031；
2.解放军第九六〇医院，山东济南 250031）

最新系统回顾性分析表明，糖尿病病程超过10年的患者易并发糖尿病足，而糖尿病足患者常常同时合并局部组织感染、皮肤病变、神经病变以及内皮血管病变，因此临床治疗难度较大；
如果不及时进行妥善处理，则会加重患者病情，甚至导致截肢或者死亡[1-2]。但糖尿病及糖尿病足的病理机制至今尚未完全阐明。

随着人类基因学研究技术的发展，长链非编码RNAs（Long non-coding RNAs，LncRNAs）逐渐进入人们视野并且引起广泛关注，被认为是糖尿病发病各个环节的关键调控因子[3]。LncRNA肺癌转移相关转录本1（MALAT1）在机体多种组织内广泛表达，最初研究发现，MALAT1与肿瘤发展关系密切，近年研究表明，LncRNA MALAT1与糖尿病及糖尿病并发症之间亦存在密切联系。LncRNA MALAT1的沉默表达可以明显缓解糖尿病诱导的视网膜血管化、血管的渗漏与视网膜炎症等[4]。由此推断其在糖尿病溃疡愈合中可能亦发挥重要作用。

细胞焦亡（pyroptosis）是一种由病原体感染或者内源性损伤等引起的溶解性细胞死亡，可分泌多种炎症细胞因子进而引发炎症级联反应[5]。对于感染性疾病，发生细胞焦亡是细胞自身的保护性反应，但是过度的细胞焦亡往往会引发组织进一步损伤及其他炎症反应，甚至导致机体死亡。最新的研究[6-7]表明，巨噬细胞焦亡可以引发糖尿病足白细胞介素（IL）-18、IL-1β的释放，导致不可控炎症反应，促进糖尿病足的病理发展。

糖尿病足归属于中医学“消渴”“脱疽”的范畴，致病机理不外乎气虚、阴虚、气血凝滞、火毒、湿热等因素，常遵循去腐生肌、标本兼治的原则[8-9]。加味四妙勇安汤具有活血止痛、清热解毒的功效，已经被证实在糖尿病足溃疡愈合中起到积极作用。有学者指出，四妙勇安汤可以促进糖尿病足溃疡患者创面血管的新生，促进创面愈合[10]；
另外在常规内科治疗的基础上，服用加味四妙勇安汤对于小面积的糖尿病足部溃疡有较好的促愈合效果[11]。但目前关于加味四妙勇安汤促创面愈合仅仅体现在临床效果评比，而对于其治疗的内在分子调控机制尚不明确。因此，本研究拟通过构建糖尿病足溃疡大鼠模型，探讨加味四妙勇安汤对LncRNA MALAT1-巨噬细胞焦亡轴的影响，以期阐明其在糖尿病足溃疡愈合中的分子作用机制，现将研究结果报道如下。

1.1 动物 40只SPF级6周龄雄性SD大鼠，体质量170～220 g，由山东省立第三医院动物饲养中心提供，动物质量合格证号：110322211100491267。饲养环境：普通饲料单笼饲养，室温控制在18～23℃，大鼠自由摄食、饮水。本动物实验方案已获得山东省立第三医院动物伦理委员会审批通过。

1.2 药物 加味四妙勇安汤组成：肉桂4.5 g，黄连8 g，薏苡仁27 g，土茯苓30 g，川牛膝13 g，丹参10 g，生甘草6 g，金银花30 g，玄参10 g，当归10 g，蒲黄8 g，垂盆草30 g。所有中药材均购自山东省立第三医院中医药药房。将上述中药材加水常规煮煎，取药汁，备用。

1.3 试剂与仪器 LncRNA MALAT1敲除质粒siLncRNA MALAT1（上海生工生物工程股份有限公司）；
链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma公司）；
白细胞介素（IL）-18、IL-1β的酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（国药化学试剂有限公司）；
Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）抗体、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）抗体、CD206抗体、消皮素D（GSDMD）抗体、pro-Caspase-1抗体、核转录因子kappaB（NF-κB）p65抗体、磷酸甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Sigma公司）；
二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定盒、十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶、电泳缓冲液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、增强化学发光（ECL）显影试剂盒（美国ABC公司）。血糖测试仪（美国强生公司）；
RT-PCR测试仪、RT-100酶标仪、Mini PRO型电泳仪及转膜仪、电泳槽、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；
台式高速离心机、微量可调节仪器（美国Beckman公司）。

1.4 分组与造模[12-13]将40只SD大鼠随机分为2组，正常组10只，2型糖尿病造模组30只。2组大鼠实验前均禁食24 h，2型糖尿病造模组大鼠于左下腹部一次性腹腔注射65.0 mg/kg STZ（由pH4.2柠檬酸钠缓冲溶液配制成10 mg/mL溶液），正常组左下腹部一次性腹腔注射等体积柠檬酸钠缓冲溶液。1周后，2型糖尿病造模组大鼠均出现多饮、多尿的现象，尾静脉抽血检测空腹血糖，若空腹血糖为12.0 mmol/L及以上则判断2型糖尿病模型构建成功。然后于上述符合要求的大鼠足背部切除一块矩形区域的皮肤组织，建立糖尿病足溃疡模型。最后将糖尿病足溃疡模型大鼠分为模型组、siLncRNA MALAT1组、加味四妙勇安汤组，每组10只。

1.5 给药 造模结束后开始给药。加味四妙勇安汤组大鼠给予加味四妙勇安汤20.0 g·kg-1·d-1[14]灌胃，每日1次，共8周；
siLncRNA MALAT1组大鼠于足部溃疡组织注射siLncRNA MALAT1慢病毒质粒（2×1010pfu，0.5 mL/只），每日1次，连续注射1周；
模型组与正常组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，共8周。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 观察大鼠足溃疡创面组织愈合情况 给药前，给药4、8周后，观察大鼠足溃疡创面组织血管、炎症、面积等变化情况。

1.6.2 计算大鼠足溃疡创面愈合面积百分比 给药前、给药8周后，采用计算机处理的透明膜适踪法纪录大鼠足溃疡部位，测量创面面积，计算创面愈合面积百分比，创面愈合面积百分比=（创面初始面积-创面残余面积）/创面初始面积×100%。

1.6.3 ELISA法检测大鼠血清IL-18、IL-1β水平 给药8周后12 h禁食，摘眼球取血，室温下静置2.5 h，4℃离心分离上清液。设定ELISA各孔位，按照试剂盒说明书步骤进行操作，应用酶标仪在450 nm波长处检测各孔内光密度（OD）值，绘制标准曲线，计算血清中IL-18、IL-1β含量。

1.6.4 免疫荧光化学染色法检测足部组织M2巨噬细胞标志蛋白（CD206）、ASC、NLRP3表达 取正常组大鼠足背部正常皮肤组织和其他各组大鼠足溃疡创面组织，制备石蜡切片，脱蜡脱水，抗原修复，血清封闭。加入稀释的CD206抗体（体积比1∶100）、ASC抗体（体积比1∶100）、NLRP3（体积比1∶100），4℃孵育过夜。用磷酸盐-Tween-20缓冲液（PBST）冲洗后，滴加DAPI避光显色5 min，冲洗后复染细胞核，用含抗荧光淬灭剂的封液进行封片。在荧光显微镜下观察采集的图像，测量积分光密度（IOD）和面积（Area）并计算出平均光密度（AOD）值，AOD=IOD/Area。

1.6.5 实时聚合酶链反应（RT-PCR）法检测足部组织LncRNA MALAT1表达 取正常组大鼠足背部正常皮肤组织和其他各组大鼠足溃疡创面组织，采用TRIzol试剂盒抽提总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA合成cDNA，按照qRT-PCR检测试剂盒说明书配制反应体系，采用2-ΔΔCt值表示LncRNAMALAT1的表达水平。LncRNA MALAT1上游引物序列为5’-ATTGGGTCCTGGACCTGGAATG C-3’，下游引物序列为5’-ACTGGCTGGACCCTG GAAATCTG-3’；
GAPDH上游引物序列为5’-TCG TGGACCTGACCTGGACCTGAAACTG-3’，下游引物序列为5’-ATCTCCTTCCTGGAACTGGACCTGG C-3’。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反应条件：95℃预变性5 min，循环1次；
95℃变性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循环40次。

1.6.6 Western Blot法检测足部组织细胞焦亡关键蛋白表达 取正常组大鼠足背部正常皮肤组织和其他各组大鼠足溃疡创面组织，加入RIPA裂解液后进行组织匀浆裂解，提取蛋白质，定量、上样，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，将检测蛋白转移到PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶封闭2.5 h，TBST清洗3次；
将PVDF膜与一抗在4℃孵育过夜，用TBST清洗3次；
PVDF膜与荧光二抗孵育1.5 h，经TBST清洗3次。采用红外成像系统进行扫描，采用ImageJ软件进行灰度分析。其中，一抗GSDMD稀释体积比例为1∶1 000、NLRP3为1∶500、pro-Caspase-1为1∶500、NF-κBp65为1∶1 000、GAPDH为1∶1 000。

1.7 统计方法 采用GraphPad Prism8.0统计软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组大鼠足溃疡创面愈合情况比较 图1结果显示：治疗前，各组大鼠足溃疡创面布满充血血管，炎症脓性反应明显；
随着治疗时间的延长，各组大鼠创面面积减小，其中，siLncRNA MALAT1组、加味四妙勇安汤组大鼠创面面积较模型组减小。

图1 各组大鼠治疗前后足溃疡创面愈合情况比较（×50）Figure 1 Comparison of wound healing of foot ulcers among various groups of rats before and after treatment（×50）

2.2 各组大鼠足溃疡创面愈合面积百分比比较表1结果显示：各组大鼠治疗8周后，足溃疡创面愈合面积百分比较治疗4周后明显升高（P＜0.05）；
与模型组同期比较，siLncRNA MALAT1组、加味四妙勇安汤组大鼠足溃疡创面愈合面积百分比升高（P＜0.05）；
2个治疗组间该指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠足溃疡创面愈合面积百分比比较Table 1 Comparison of the percentage of wound healing area of foot ulcers among various groups of rats （±s，%）

表1 各组大鼠足溃疡创面愈合面积百分比比较Table 1 Comparison of the percentage of wound healing area of foot ulcers among various groups of rats （±s，%）

注：①P＜0.05，与同组治疗4周后比较；
②P＜0.05，与模型组同期比较

组别模型组siLncRNAMALAT1组加味四妙勇安汤组鼠数/只10 10 10创面愈合面积百分比治疗4周后24.78±2.34 43.68±3.24②47.08±3.78②治疗8周后38.90±4.23①68.90±4.55①②75.46±8.63①②P值0.045 0.020 0.008

2.3 各组大鼠足部组织LncRNA MALAT1表达比较 表2结果显示：与正常组足背部正常皮肤组织比较，模型组大鼠足溃疡创面组织LncRNA MALAT1表达水平明显上升（P＜0.05）；
与模型组比较，siLncRNA MALAT1组、加味四妙勇安汤组LncRNA MALAT1表达水平均下降（P＜0.05）；
2个治疗组间该指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠足部组织LncRNA MALAT1表达比较Table 2 Comparison of tissue LncRNA MALAT1 expression in the feet among various groups of rats （±s）

表2 各组大鼠足部组织LncRNA MALAT1表达比较Table 2 Comparison of tissue LncRNA MALAT1 expression in the feet among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；
②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组siLncRNA MALAT1组加味四妙勇安汤组鼠数/只10 10 10 10 LncRNA MALAT1（2-ΔΔCt）0.428±0.017 1.344±0.233①0.785±0.150②0.640±0.102②

2.4 各组大鼠血清中IL-18、IL-1β水平比较 表3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清IL-18、IL-1β水平显著上升（P＜0.05）；
与模型组比较，siLncRNA MALAT1组、加味四妙勇安汤组血清IL-18、IL-1β水平均下降（P＜0.05）；
2个治疗组间各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清中白细胞介素（IL）-18、IL-1β水平比较Table 3 Comparison of IL-18 and IL-1βlevels in serum among various groups of rats （±s，ng·L-1）

表3 各组大鼠血清中白细胞介素（IL）-18、IL-1β水平比较Table 3 Comparison of IL-18 and IL-1βlevels in serum among various groups of rats （±s，ng·L-1）

注：①P＜0.05，与正常组比较；
②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组siLncRNAMALAT1组加味四妙勇安汤组鼠数/只10 10 10 10 IL-18 3.26±1.52 25.08±4.59①19.44±3.21②14.55±3.40②IL-1β 13.82±4.55 63.45±11.78①50.67±6.78②44.35±5.22②

2.5 各组大鼠足部组织M2巨噬细胞标志蛋白（CD206）、ASC、NLRP3表达水平比较 表4结果显示：与正常组足背部正常皮肤组织比较，模型组大鼠足溃疡创面组织ASC、NLRP3蛋白表达水平均明显上升，CD206蛋白表达水平下降（均P＜0.05）；
与模型组比较，siLncRNA MALAT1组、加味四妙勇安汤组ASC、NLRP3蛋白表达水平下降，CD206表达水平上升（P＜0.05）；
2个治疗组间各指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。提示LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安汤灌胃均可以上调糖尿病大鼠足溃疡创面组织M2型巨噬细胞比例，同时下调巨噬细胞内细胞焦亡关键因子的表达，抑制巨噬细胞焦亡能力。

表4 各组大鼠足部组织M2巨噬细胞标志蛋白（CD206）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）平均光密度比较Table 4 Comparison of the average optical density of tissue M2 macrophage marker protein（CD206），ASC and NLRP3 in the feet among various groups of rats （±s）

表4 各组大鼠足部组织M2巨噬细胞标志蛋白（CD206）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）平均光密度比较Table 4 Comparison of the average optical density of tissue M2 macrophage marker protein（CD206），ASC and NLRP3 in the feet among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；
②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组siLncRNA MALAT1组加味四妙勇安汤组鼠数/只10 10 10 10 CD206平均光密度0.254±0.012 0.012±0.002①0.155±0.014②0.187±0.019②ASC平均光密度0.023±0.003 0.438±0.017①0.245±0.010②0.203±0.016②NLRP3平均光密度0.014±0.003 0.489±0.021①0.288±0.012②0.187±0.018②

2.6 各组大鼠足部组织GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κBp65蛋白表达比较 图2结果显示：与正常组足背部正常皮肤组织比较，模型组大鼠足溃疡创面组织GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κB p65蛋白表达水平均明显上升（P＜0.05）；
与模型组比较，siLncRNA MALAT1组、加味四妙勇安汤组GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κB p65蛋白表达水平均下降（P＜0.05）；
2个治疗组间各指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。提示LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安汤灌胃均可以下调大鼠足溃疡创面组织内细胞焦亡蛋白表达，抑制细胞焦亡的发生。

图2 各组大鼠足部组织消皮素D（GSDMD）、Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）、pro-Caspase-1、核转录因子kappaB（NF-κB）p65蛋白表达比较Figure 2 Comparison of protein expressions of tissue GSDMD，NLRP3，pro-Caspase-1 and NF-κB p65 in the feet among various groups of rats

中医学认为，糖尿病足主要是由于消渴日久，气阴两虚，热毒、瘀血积聚而导致脉络气血运行不畅、肢端失养所致，祛腐生肌、化瘀通脉、清热解毒以及标本兼治为主要治疗方法[15-17]。加味四妙勇安汤具有活血化瘀、清热解毒的功效，方中：黄连、肉桂解毒止痛、助阳，川牛膝可以直达病灶部位，消肿散结，丹参、蒲黄化瘀止痛，甘草、当归、金银花、玄参活血止痛、清热解毒，薏苡仁、土茯苓、垂盆草清热除湿解毒。本研究结果表明，加味四妙勇安汤可有效促进糖尿病大鼠足溃疡创面愈合。

研究[18]表明，LncRNA MALAT1参与糖尿病及其并发症的发生及发展过程。糖尿病患者血清LncRNA MALAT1表达明显升高[19]；
内皮细胞沉默LncRNA MALAT1后，其炎性因子IL-6、TNF-α及细胞黏附因子等水平均下降[20]；
高血糖引起的视网膜病变内皮细胞中LncRNA MALAT1表达亦明显上升[21]。IL-18是活化的单核巨噬细胞分泌的一种前炎症因子，在2型糖尿病的发生发展过程中起中心介质作用，在2型糖尿病前期即出现升高，可作为2型糖尿病发生、病情变化及预后的预测因子[22]。IL-1β是NLRP3炎性小体活化后产生的主要炎性分子。IL-1β在2型糖尿病的发生发展中发挥重要作用，被认为是2型糖尿病的重要驱动者。在慢性高血糖状态下，机体内IL-1β持续升高，其受体表达上调，既可引起β细胞凋亡及胰岛素抵抗，又可和其他炎性因子如肿瘤坏死因子（TNF）等协同干扰体内葡萄糖代谢平衡[23]。而糖代谢紊乱作为危险信号，进一步激活IL-1β的平台NLRP3炎性小体[22]。本研究结果显示，糖尿病大鼠足溃疡创面组织LncRNA MALAT1表达升高，血清炎症因子IL-18、IL-1β、NLRP3水平升高，而加味四妙勇安汤的干预可以明显下调足溃疡创面组织LncRNA MALAT1的表达，降低血清IL-18、IL-1β、NLRP3水平，表明足溃疡创面组织存在明显的炎症反应，加味四妙勇安汤抑制糖尿病足溃疡大鼠创面炎症反应主要是通过抑制LncRNA MALAT1的表达来实现。

适度的炎症反应对机体产生保护作用，若炎症反应发生级联放大出现失控，则会导致机体自身免疫系统的破坏，促进疾病的发展。炎症小体本质上属于多聚蛋白复合物，是控制炎症反应进程和协调机体免疫功能的信号平台，最新证据[24-25]表明，炎症小体NLRP3所介导的细胞焦亡在糖尿病足发生及发展中扮演了重要的角色。在巨噬细胞焦亡过程中，炎症小体活化是必要因素，诸多危险性信号如内毒素（LPS）、活性氧（ROS）产生、溶酶体破裂等均可以被巨噬细胞胞浆内的感受器（NOD-like receptors，NLR）感知并且识别，进而引起IκB发生磷酸化，调控下游的NF-κB入核，而NF-κB是诱导IL-1β和NLRP3蛋白合成的关键性因子，为进一步炎症小体的组装提供原材料。ASC是一种由2个“死亡折叠”结构域组成的蛋白，拥有上述结构域的ASC可以作为接头蛋白将通路上游的炎症传感器分子进行组装成完整的炎症小体，参与细胞焦亡[25-26]。GSDMD蛋白是Caspase-1和细胞焦亡主要的底物成分之一，与细胞焦亡亦密切相关[27]。本研究结果显示，糖尿病足溃疡模型建立后，足溃疡创面组织NF-κB p65、IL-1β、pro-Caspase-1、NLRP3、ASC、GSDMD等细胞焦亡关键因子表达均明显上调，提示糖尿病足溃疡的发病与巨噬细胞焦亡密切相关。而LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安汤干预均可以抑制足溃疡创面组织NF-κBp65、IL-1β、pro-Caspase-1、NLRP3、ASC、GSDMD等细胞焦亡关键因子上调的趋势，下调其表达，提示LncRNA MALAT1参与糖尿病足溃疡大鼠创面巨噬细胞焦亡过程，且受加味四妙勇安汤调控。

CD206是M2型巨噬细胞的特异性标志物，其表达量可以反映M2型巨噬细胞的组分及比例[28]。本研究结果显示，糖尿病足溃疡模型大鼠CD206表达较正常组明显下降，表明模型建立后所蓄积的炎症反应可能是M2型巨噬细胞向M1型转化所致。M2型巨噬细胞数量减少导致促炎性的NLRP3、NF-κB表达上调，进一步招募ASC参与NLRP3的合成，这亦说明，糖尿病足溃疡模型大鼠创面组织巨噬细胞发生了焦亡反应。给予加味四妙勇安汤干预后，创面组织LncMALAT1表达受到抑制，使得CD206表达比例提升，巨噬细胞向M2抗炎型转化，NLRP3、NF-κB表达减弱，巨噬细胞焦亡比例降低，进而减少炎性因子IL-18、IL-1β的释放，最终促进大鼠糖尿病足溃疡创面的愈合。

综上所述，加味四妙勇安汤可通过下调创面组织LncRNA MALAT1表达抑制巨噬细胞焦亡，从而促进糖尿病足溃疡的愈合，效果显著，值得进一步推广应用。