结肠癌转移相关基因1、磷酸化需肌醇酶1蛋白在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中的表达及其与临床分期的关系

张 君，李阿洁

(1.空军军医大学唐都医院耳鼻咽喉头颈外科,陕西 西安 710038;2.铜川市人民医院耳鼻喉科,陕西 铜川 727000)

鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤(Sinus nasal inverted papilloma，SNIP)是临床比较常见的一种鼻腔肿瘤，这种肿瘤会对周围结构产生破坏、易侵袭、易复发，而且癌变发生率较高[1]。流行病学研究[2]发现，SNIP发病多为男性，且多为良性肿瘤，其发生率约为原发性鼻腔肿瘤的0.5%～4.0%。国际上将乳头状瘤分为蕈状、柱状和内翻性三种组织类型，且发生多与人乳头状瘤病毒相关，患者临床多表现为涕中带血、流涕、嗅觉减退、头痛以及鼻塞等。随着患者肿瘤进一步扩大，临床分期进展，可累及的部位也逐渐增加，出现对应的体征和症状，降低患者生活质量。研究[3]发现，对SNIP早诊断并确定其发展情况对于疾病的治疗效果及预后具有重要影响。当前对于SNIP分期多采取Krouse的分期理念进行[4]，但此种评价方式需要对患者进行影像学、病理学和生化指标等多项诊断，辨别较为繁琐。所以，如何找到更准确、便捷的疾病严重程度判断方式，及时明确SNIP诊断和预后判断成为研究热点内容。研究[5-6]发现，结肠癌转移相关基因1(Metastasis related gene 1 of colon cancer，MACC1)表达可通过提升细胞转移和迁移能力，促进肿瘤细胞扩散与浸润。磷酸化需肌醇酶1蛋白(phosphorylated inositol-requiring enzyme 1 protein,p-IRE1)的表达可通过对内质网所产生的损伤，增加内质网折叠障碍，从而促进肿瘤细胞病变过程。因此，为了提升SNIP的诊断分析效能，本研究探讨MACC1和p-IRE1在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中的表达及其与临床分期的关系。

1.1 研究对象 筛选我院80例鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者，纳入时间为2018年1月至2020年1月，均行外科手术治疗，在手术过程中取患者瘤组织进行病理诊断，依照不同分期将所有患者分为四组，即T1组(n=18)、T2组(n=23)、T3组(n=25)和T4组(n=14)。病例纳入标准：所有患者均采取鼻内镜下鼻腔鼻窦肿瘤切除术进行治疗，且术后病理诊断确诊为鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤；
Krouse分期为T1～T4期[病灶没有侵袭鼻窦和鼻腔以外的部分，且无恶变为T1期；
肿瘤发展到筛窦和窦口窦道鼻道复合体，可能累及鼻腔和上颌窦内侧部分，且无恶变为T2期；
肿瘤主要在上颌窦，蝶窦和(或)额窦，同时可能累积鼻腔或筛窦，无恶变为T3期；
肿瘤累及超出鼻窦或鼻腔范围，例如翼腭窝、颅内或眼眶等，出现恶变为T4期]；
手术前后所有患者均未接受过非甾体抗炎药物治疗和放化疗；
病例资料完整；
对本研究知情并签署同意书。排除标准：合并鼻咽癌或其他癌症者；
合并严重重要器官功能障碍者；
不同意进行组织检查者；
年龄>80岁；
合并缺氧性疾病者；
中途退出或不配合随访者。本研究经我院伦理委员会批准。80例鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者中男46例，女34例；
年龄34～76岁，平均(56.36±6.32)岁。另选取20例同期来我院体检的健康志愿者鼻腔黏膜组织作为对照组，其中男11例，女9例；
年龄35～73岁，平均(55.63±5.27)岁。

1.2 研究方法 取80例患者的鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织和对照组志愿者的鼻腔黏膜组织进行切片，应用免疫组织化学染色法检测组织的MACC1和p-IRE1表达水平，具体方法为：组织切片应用梯度乙醇脱水和二甲苯脱蜡之后，应用枸橼酸抗原修复液进行抗原热修复，并放置在体积分数为3%的双氧水10 min，温度为37 ℃，将内源性过氧化物酶灭活，并应用PBS进行漂洗3次，每次5 min；
应用体积分数为20%的正常羊血清进行室温孵育，时间为15 min，封闭非特异性抗原，随后用滤纸将多余封闭液吸取，滴入由博士德生物工程有限公司提供的MACC1和p-IRE1抗体，放置在4 ℃的冰箱内，孵育过夜。将切片放置在PBS中震荡漂洗3次，每次15 min，注意动作要轻柔。随后将组织周围的液体擦干后滴入生物素标记羊抗兔IgG，室温孵育30 min后进行漂洗，再应用链霉素卵白素工作液孵育15 min，再次漂洗，应用H2O2或DAB进行染色，4～10 min后，进行漂洗，随后封片保存。并在光镜下进行观察，光镜倍数为400倍，其中阳性细胞为棕黄色颗粒，分别计数细胞总数与阳性细胞数，计算MACC1和p-IRE1阳性细胞数的表达率平均值。

对80例鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者在治疗3年后进行门诊复查随访，其中包括血液生化检查、骨扫描，腹部B超、胸部CT、颈部+鼻腔鼻窦MRI、体格检查来综合判定患者预后情况，将出现鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤复发或癌变者分为预后不良组，将其他患者分为预后良好组。收集所有患者一般资料，包括性别、年龄、临床分期、是否初发、组织分化程度等。并搜集所有患者鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织MACC1和p-IRE1表达水平，具体免疫组化法同上。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件分析。计数资料以[例(%)]表示，行χ2检验；
相关性分析采用Spearman相关系数；
采用Logistic回归分析单因素指标与预后的关系；
P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组患者一般资料及MACC1和p-IRE1表达情况对比 预后良好组与预后不良组患者性别、年龄、是否初发情况对比无统计学差异(均P>0.05)，两组患者临床分期、组织分化程度、MACC1和p-IRE1阳性情况对比有统计学差异(均P<0.05)，见表1。

表1 两组患者一般资料与临床指标对比[例(%)]

2.2 不同临床分期患者MACC1和p-IRE1表达情况对比 不同临床分期患者MACC1和p-IRE1组织表达情况对比差异有统计学意义(均P<0.05)，T4组明显高于T3组、T2组、T1组和对照组(均P<0.05)，见表2。

表2 不同临床分期患者MACC1和p-IRE1表达情况对比(例)

2.3 MACC1和p-IRE1表达情况与临床分期的相关性 Spearman相关分析结果显示MACC1和p-IRE1与鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床分期呈正相关(r=0.423、0.539，均P<0.05)，见表3。

表3 MACC1和p-IRE1表达情况与临床分期的相关性

2.4 鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织MACC1和p-IRE1表达对患者预后的预测价值 经Logistic回归分析发现：MACC1和p-IRE1为鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤的预后独立因素(均P<0.05)，见表4。

表4 鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织MACC1和p-IRE1表达对患者预后的预测价值

SNIP的主要特点为局部侵袭强、术后复发率高，因此很容易发展为鳞状细胞癌，危险性较高，临床诊断较为复杂。SNIP虽然属于良性上皮源性肿瘤，但它特有的生物学行为特征使多数学者认为其属于交界性肿瘤的一种，临床治疗原则为彻底切除肿瘤，所以多以手术治疗为主，但术后复发率较高，因此早期诊断与预测SNIP的预后成为临床研究热点[7-9]。随着SNIP组织内蛋白检测发展，越来越多学者认为，通过SNIP组织内相关基因和蛋白的检测对于SNIP诊断与预后预测具有重要价值。其中MACC1位于人7号染色体上，由2个羟基、SH3及ZU5结构组成，其中MACC1总的2个羟基结构内的酪氨酸残基会出现DNA损失，随后导致残基出现磷酸化，促使信号传导通路呈现级联酶促反应，造成细胞无限制分裂，最终肿瘤细胞转移和侵袭。研究[10-12]发现，正常组织中MACC1蛋白多为低表达或不表达，而在肺癌、胃癌、肝癌等多种恶性实体肿瘤呈现出高表达状态，且肿瘤迁移发生率较高。IRE1是一种苏氨酸或丝氨酸蛋白酶，可感受未折叠蛋白和错误折叠蛋白内质网管蓄积情况，进而改变相应激酶结构，随后磷酸化导致p-IRE1的增加，发生下游生物学效应。研究[13-14]发现，IRE1在乳腺癌、宫颈癌等组织表达过高，且与临床分期存在一定相关性。因此，本研究主要分析MACC1和p-IRE1在SNIP组织中的表达及其与临床分期的关系，希望能够为SNIP的诊断与治疗提供参考。

本研究结果表明，不同临床分期患者MACC1和p-IRE1组织表达水平对比差异有统计学意义，T4组明显高于T3组、T2组、T1组和对照组，由此证明，SNIP临床分期越高，疾病越严重，则MACC1和p-IRE1阳性表达率越高，与张贵等[15]研究相似。张贵等[15]研究发现，MACC1和p-IRE1水平与鼻咽癌的发生发展存在一定关系。这主要是因为，MACC1可通过对肿瘤细胞生物学特征所产生的影响来提升肿瘤细胞变形能力，从而促进肿瘤细胞对于邻近的鼻黏膜组织产生浸润。另外，MACC1上升还能够导致细胞间质成分分解，从而为肿瘤细胞转移提供有利条件。p-IRE1属于磷酸化需醇激酶的一种，可通过对内质网折叠错误产生影响的同时，导致机体肿瘤细胞内核转录基因NF-κB激活，促使肿瘤细胞DNA出现持续性增殖的过程[16]。Spearman相关分析结果显示MACC1和p-IRE1与SNIP临床分期呈正相关。提示MACC1和p-IRE1组织表达水平越高，SNIP临床分期越高。Lin等[17]研究发现，MACC1基因多态性与肝细胞癌的临床分期呈正相关。Kobelt等[18]研究发现，新确定的MEK-1酪氨酸磷酸化靶点MACC1可通过批准的MEK-1抑制剂进行药物治疗，以限制结直肠癌转移，与本研究结果相符。另外，童晶涛等[19]也研究发现，鼻咽癌癌组织中需肌醇酶1蛋白表达水平与鼻咽癌的发生发展呈明显相关性。本研究预后良好组与预后不良组患者性别、年龄、是否初发情况对比差异无统计学意义，两组患者临床分期、组织分化程度、MACC1和p-IRE1阳性情况对比差异有统计学意义；
经Logistic回归分析发现：MACC1和p-IRE1为SNIP的预后独立因素。因此，临床可考虑应用MACC1和p-IRE1表达水平来对SNIP的预后进行预测。这主要是因为，MACC1表达上升能够提升肿瘤细胞转移能力，促进肿瘤细胞扩散，而p-IRE1上升会提升NF-κB激活程度，促进下游核转录因子激活，促进肿瘤细胞增殖[20]。

综上所述，SNIP组织中MACC1和p-IRE1阳性表达率明显高于健康鼻腔黏膜组织，且MACC1和p-IRE1表达水平与SNIP的临床分期呈正相关。另外，可通过MACC1和p-IRE1阳性表达来预测SNIP患者的预后情况，且MACC1和p-IRE1为SNIP的预后独立因素。