特应性皮炎患者外周血中嗜碱性粒细胞CD63、CD203c和FcεRI的表达

李璟依,张慧云,何韶衡,孙健

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种与过敏相关的常见慢性复发性皮肤病。根据血清总IgE水平和是否具有特异性IgE，AD可以分成内源性AD(iAD)和外源性AD(eAD)两种类型。嗜碱性粒细胞通过抗原呈递、Th2型免疫反应的启动和维持以及分泌细胞因子等多种途径参与过敏性疾病的发生。有研究[1-2]发现，在特应性皮炎患者的病变组织尤其是斑贴试验测试部位，存在着嗜碱性粒细胞浸润，且AD患者皮肤中嗜碱性粒细胞数量显著升高[3]。另外，AD患者外周血中存在特异性IgE介导的嗜碱性粒细胞激活[4]，这些研究提示嗜碱性粒细胞参与了AD的发生发展。

CD63是一种溶酶体相关膜蛋白(LAMP)，早在1991年CD63就被发现与嗜碱性粒细胞激活有关，且可以作为嗜碱性粒细胞激活的标记物[5]。CD203c是一种糖基化Ⅱ类跨膜分子，又称为外核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶3(NPP3)，常表达于肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面[6]。作为嗜碱性粒细胞的激活标记物，CD203c具有比CD63更高的敏感性[7]。FcεRI即高亲和力IgE受体，在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上表达，通过抗原交联特异性IgE诱导细胞活化[8]。流式细胞术分析时常用的指标有百分比和平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)，与传统的百分比门控策略相比，使用MFI进行分析是一种更敏感和可靠的方法[9]。目前，对于特应性皮炎患者外周血嗜碱性粒细胞上CD63、CD203c和FcεRI表达的研究较少，且尚未有研究对于内、外源性AD嗜碱性粒细胞表达水平进行比较。本研究运用CCR3+CD123+HLA-DR-标记嗜碱性粒细胞，采用流式细胞术检测内源性AD(intrinsic atopic dermatitis,iAD)、外源性AD(extrinsic atopic dermatitis,eAD)嗜碱性粒细胞表面CD63、CD203c和FcεRI的表达，探讨外周血嗜碱性粒细胞尤其是其表面CD63、CD203c和FcεRI表达与不同类型特应性皮炎的关系，希望能为AD的诊断和治疗提供新的思路。

1.1实验试剂及仪器 APC偶联抗人CCR3抗体、FITC偶联抗人CD123抗体、APC/Cy7偶联抗人HLA-DR抗体、PE/Cy7偶联抗人CD63抗体、PE偶联抗人CD203c抗体、PerCP偶联FcεRI抗体、FcR阻断剂、红细胞裂解液、FACSVerse流式细胞仪等购自美国Biolegend公司。PBS缓冲液购自美国Solarbio公司。

1.2研究对象 选取2021年4月-2021年12月在锦州医科大学附属第一医院确诊的AD患者36例(表1)，其中内源性AD患者18例、外源性AD患者18例，并招募20例健康人(healthv control,HC)作为对照组。AD患者诊断符合特应性皮炎Williams诊断标准，且要求所有AD患者至少2周前停止服用抗过敏药物。本研究获得了锦州医科大学附属第一医院伦理委员会的批准，志愿者均签订了知情同意书。

表1 志愿者的一般资料Tab.1 General information of the volunteers

1.3研究方法 对每位研究对象采集4 mL外周血，置于含EDTA抗凝剂的采血管中。1 200 r/min离心血液10 min，抽出血浆后补充1640培养基。加入5 μL FITC-CD123、APC-CCR3、APC/Cy7-HLA-DR标记嗜碱性粒细胞，实验管加入5 μL PE/Cy7-CD63、PE-CD203c和PerCP-FcεRI，同型管加入相应的同型抗体；
室温避光孵育15 min；
加入1.5 mL红细胞裂解液，吹打混合，室温下避光孵育12 min；
1 200 r/min离心6 min，弃去红色上清液；
加入1 mL 1×PBS，混合后再次以1 200 r/min离心6 min，弃去上清液；
加入200 μL PBS，使用流式细胞仪检测，FlowJo软件分析结果。使用流式细胞术检测AD患者嗜碱性粒细胞富集群(设门方法见图1)。

图1 嗜碱性粒细胞富集群的设门方法Fig.1 Gating strategies of basophil-enriched cells

1.4统计学处理 使用统计软件SPSS23.0分析数据。本研究数据属于非正态计量资料，采用中位数(M)和四分位间距(IQR)表示，使用非参数检验Manner-Whitney进行检验，P<0.05为差异有统计学意义，统计学界值为1.96。

2.1AD患者外周血嗜碱性粒细胞表达结果 AD患者粒细胞群中嗜碱性粒细胞MFI较健康对照组增加了2.5倍(Z=-6.156，P<0.01，图2a)，内源性AD组与外源性AD组的嗜碱性粒细胞MFI差异无统计学意义。各型AD患者嗜碱性粒细胞比例与健康组比较差异无统计学意义，见表2。

MFI expression in granulocyte population of basophils between groups；
MFI expression in granulocyte population of CD63+ basophils between groups；
Percentage of CD63+ basophils in the mononuclear cell population between groups图2 各组间嗜碱性粒细胞和CD63+嗜碱性粒细胞在粒细胞群和单个核细胞群中的表达比较Fig.2 Comparison of the expression of basophils and CD63+ basophils in the granulocyte population and the mononuclear cell population between groups

表2 各组嗜碱性粒细胞表达水平比较 [M(IQR)]Tab.2 Comparison of basophil expression levels between groups [M (IQR)]

2.2AD患者外周血CD63+嗜碱性粒细胞表达水平 AD患者粒细胞群中CD63+嗜碱性粒细胞MFI较对照组升高了34%(Z=-2.249，P<0.05，图2b)，且AD患者单个核细胞群中CD63+嗜碱性粒细胞比例较健康对照组增加了23%(Z=-3.688，P<0.01，图2c)，不同分型AD患者间CD63+嗜碱性粒细胞的比例和MFI差异均无统计学意义，见表3。

表3 各组CD63+嗜碱性粒细胞比较 [M(IQR)]Tab.3 Comparison of CD63+ basophils between groups [M(IQR)]

2.3AD患者外周血CD203c+嗜碱性粒细胞表达水平 与健康对照组相比，AD患者的CD203c+嗜碱性粒细胞MFI在粒细胞群中升高了23%(Z=-2.112，P<0.05，图3a)、在单个核细胞群中升高了2%(Z=-2.061，P<0.05，图3b)，且AD患者外周血粒细胞群中CD203c+嗜碱性粒细胞比例升高了4.8倍(Z=-4.925，P<0.01，图3c)，但内、外源性AD患者之间在外周血CD203c+嗜碱性粒细胞的比例和MFI上差异均无统计学意义，见表4。

MFI expression in granulocyte population of CD203c+ basophils between groups；
Percentage of CD203c+ basophils in the granulocyte population between groups；
MFI expression in mononuclear cell population of CD203c+ basophils between groups图3 各组间CD203c+嗜碱性粒细胞在粒细胞群和单个核细胞群中的表达比较Fig.3 Comparison of the expression of CD203c+ basophils in the granulocyte population and themononuclear cell population between groups

表4 各组CD203c+嗜碱性粒细胞比较 [M(IQR)]Tab.4 Comparison of CD203c+ basophils between groups [M(IQR)]

2.4AD患者外周血FcεRI+嗜碱性粒细胞表达水平 AD患者外周血粒细胞群FcεRI+嗜碱性粒细胞比例较健康对照组升高了6.3倍(Z=-4.694，P<0.01，图4)，AD及其不同分型FcεRI+嗜碱性粒细胞MFI差异均无统计学意义，且内、外源性AD患者外周血FcεRI+嗜碱性粒细胞比例差异无统计学意义，见表5。

表5 各组FcεRI+嗜碱性粒细胞比较 [M(IQR)]Tab.5 Comparison of FcεRI+ basophils between groups [M(IQR)]

图4 各组FcεRI+嗜碱性粒细胞在粒细胞群中百分比的流式代表图Fig.4 Flow cytometric representation of the percentage of FcεRI+ basophils in each group of granulocyte populations

特应性皮炎可分为外源性AD和内源性AD两种类型，其中内源性AD血清IgE水平正常且没有特异性IgE致敏，外源性AD则表现为血清总IgE水平升高且具有特异性IgE致敏[10]。外源性AD患者常表达高水平的Th2型细胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13[11]，并且具有更明显的嗜酸性粒细胞升高倾向[12]。而内源性AD更倾向于表达高水平的Th17和 Th22 型细胞因子[13]。另外，在血浆氨基酸代谢方面，急性发作期外源性AD与内源性AD在组氨酸代谢通路上具有显著差异，具体体现为内源性AD的组氨酸代谢水平低[14]。在本研究中，并未发现内、外源性AD在外周血嗜碱性粒细胞及其激活物标志上有差异，这提示嗜碱性粒细胞作为过敏反应的初级效应细胞，在内源性AD和外源型AD的发病过程中都起作用。

目前认为，AD与免疫失衡、皮肤屏障功能紊乱、皮肤菌群异常等因素密切相关。嗜碱性粒细胞在AD的免疫失衡中发挥重要作用，在特应性皮炎小鼠模型中，IL-4表达水平升高[15]，嗜碱性粒细胞是皮肤中IL-4的初始和主要来源[16-17]，嗜碱性粒细胞来源的IL-4对ILC2的增殖至关重要，它可以诱导ILC2激活和AD样皮肤炎症[2]。

CD63和CD203c是目前评估嗜碱性粒细胞活化的常用标志物[18-19]。CD203c和CD63在嗜碱性粒细胞活化早期就可以受到FcεRI介导的反应上调，在嗜碱性粒细胞活化晚期也受细胞因子介导从而发挥作用[20]。在20世纪90年代早期，CD63的发现促进了利用流式细胞术监测嗜碱性粒细胞的过敏原特异性激活技术的发展[21]。在嗜碱性粒细胞活化时，处于胞内颗粒中的CD63会随着胞吐作用高表达于细胞表面，这一特性使CD63可以表示嗜碱性粒细胞脱颗粒。本研究发现，AD患者外周血嗜碱性粒细胞CD63的表达增强，这提示嗜碱性粒细胞脱颗粒参与了AD发病。在血细胞中，CD203c只在嗜碱性粒细胞上恒定表达，这使它可以作为嗜碱性粒细胞的激活标记物。本研究发现，AD患者CD203c+嗜碱性粒细胞的表达上调，与Wang等[22]的研究结果一致，进一步验证了激活的嗜碱性粒细胞参与AD发病这一假设。FcεRI在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上表达，受到抗原刺激时，细胞表面的FcεRI会与IgE交联形成复合物导致细胞活化[23]，可作为细胞致敏的标记物，已有研究[24]发现表现出特应性的慢性荨麻疹患者其FcεRI水平显著升高。本研究观察到，AD患者FcεRI+嗜碱性粒细胞比例较健康对照升高，提示处于致敏状态的嗜碱性粒细胞在AD发生发展中起到一定作用。

总之，AD发病原因复杂，本研究发现AD嗜碱性粒细胞及其表面CD63、CD203c和FcεRI表达上调，提示活化的嗜碱性粒细胞及其表面CD63、CD203c和FcεRI参与AD的进程，检测嗜碱性粒细胞及其相关分子对诊断AD具有一定意义，未来可考虑研发嗜碱性粒细胞活化的阻断剂从而治疗AD。