毛果杨接种双色蜡蘑培养外生菌根的方法及其对毛果杨生长的影响

马嘉楠, 杨颖丽

(西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730000)

菌根是真菌与植物根系形成的共生体，一般分为外生菌根和内生菌根.菌根在陆地植物营养器官中普遍存在.世界上约95%的维管束植物属于典型的菌根家族植物[1]，虽然只有约3%的种子植物能够与外生菌根真菌建立起菌根共生体系，但这些植物种类是温带、寒带和部分热带地区森林和林地的主要树种[2].外生菌根真菌在温带和北方森林生态系统中占主导地位[3]，其能与植物根部形成菌根共生结构，即菌根的菌丝一部分连接植物根系而另一部分延伸到土壤中，增强宿主植物对土壤中水分和营养元素(特别是氮、磷)的吸收、利用，促进植物生长并增强植物的抗逆性[4-5].有关外生菌根共生体建立过程的研究较少[6]，在担子菌中，双色蜡蘑(Laccariabicolor)—毛果杨(Populustrichocarpa)[7]、松乳菇(Lactariusdeliciosus)—草莓树(Arbutusunedo)[8]、黑孢块菌(Tubermelanosporum)—冬青栎(Quercusilex)幼苗[9]等几种外生菌根的共生建立过程目前均有较多研究.对外生菌根的培养方法如温室土培[10]和盆栽土培[11]有见报道.Souza et al[12]以泥炭—蛭石混合物作为基质培养桉树外生菌根，而Vuorinen et al[13]在硅基固态培养基中培养真菌菌丝.随着菌根真菌与宿主植物互作的分子机制等研究工作的不断深入，建立不同外生菌根真菌与宿主植物形成外生菌根的无菌实验模型也显得更为迫切.

双色蜡蘑属于担子菌亚门(Basidiomycotina)轴腹菌科(Hydnangiaceae)蜡蘑属(Laccaria)，通过定殖于植物根部[14]，形成菌根菌丝网络能提高植物的抗病性和抗逆性[15].杨树广泛分布于欧、亚和北美地区，具有生长快、产量高、易扩繁与适应性强等特性，多数种类具有较强的适应性[16].目前双色蜡蘑与毛果杨都已完成基因组测序[17-18]，因此毛果杨-双色蜡蘑共生体系成为研究林木外生菌根发育分子机制的理想模型.本研究以毛果杨和双色蜡蘑为供试材料，以石英砂为基质体外培养外生菌根，从形态学方面鉴定外生菌根，并研究了外生菌根真菌对共生植物的影响，旨在为外生菌根真菌与植物相互的分子机制研究提供参考.

1.1 供试材料

真菌菌株双色蜡蘑和毛果杨组培幼苗，由法国农业科学院Francis Martin院士惠赠.

1.2 方法

1.2.1 双色蜡蘑的培养 双色蜡蘑的菌丝体在固体培养基[Thiamine 0.05 g·L-1，CaCl20.05 g·L-1，NaCl 0.025 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1，(NH4)2HPO40.25 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.001 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，麦芽糖提取物3 g·L-1，酵母提取物0.5 g·L-1]上培养，pH为5.8.25 ℃下暗培养7 d后转接到200 mL的MMN液体培养基中培养7 d，温度25 ℃，转速200 r·min-1.培养好的菌丝用三层纱布过滤后备用.

1.2.2 毛果杨幼苗的培养 毛果杨幼苗在培养瓶中生长3～4周后，剪掉多余叶片，并剪切为2～3 cm长的茎段，在生根培养基(2%蔗糖+1 mg·L-1吲哚丁酸IBA)中培养2～3周后备用.培养条件为：光周期16 h(白天)，暗周期8 h(夜晚)；
温度为25 ℃(白天)和18 ℃(夜晚)，相对湿度为50%～60%，光照度为14 000 lx.

1.2.3 毛果杨根部接种双色蜡蘑 培养瓶中装入150 g石英砂，在25 mL培养液(Thiamine 0.05 g·L-1,CaCl20.05 g·L-1,NaCl 0.025 g·L-1,KH2PO40.5 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1,(NH4)2HPO40.25 g·L-1,FeSO4·7H2O 0.001 g·L-1,葡萄糖1 g·L-1)中培养，pH为5.8.121 ℃灭菌20 min，备用.将3.5 g培养好的菌丝接种到杨树幼苗根部，置于装有石英砂的培养瓶中培养3周.培养条件：光周期16 h(白天)，暗周期8 h(夜晚)，温度23 ℃(白天)，光照度14 000 lx.对照组为没有菌丝的共培养培养液，每种处理设置6组重复，用于株高和鲜重生物量的测定.

1.2.4 外生菌根切片染色 毛果杨幼苗和双色蜡蘑菌丝共培养3周后，对杨树幼苗的菌根进行观察分析.新鲜的外生菌根用多聚甲醛固定样品4 h后，使用PBS溶液清洗3遍；
随后用4%(质量分数)琼脂糖进行包埋.使用振动切片机(Leica VT1000 S)制备横切片(厚度25 μm).用小麦凝集素(WGA染料，终浓度为10 μg·mL-1)和碘化丙啶(PI染料，终浓度为1 μg·mL-1)进行染色，染色0.5 h后用PBS溶液清洗3次.利用激光共聚焦显微镜(Olympus FV3000)观察菌根的形态.激发波长为488、561 nm.

1.2.5 毛果杨株高鲜重的测定 从石英砂中取出杨树苗，清水洗净根部残留的石英砂，使用直尺测量株高；
将杨树苗沥干水分后，使用精密天平测定其鲜重.

1.2.6 数据处理 采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，使用Origin 2018软件绘图.

2.1 毛果杨菌根的形成

杨树幼苗和双色蜡蘑在无菌环境下共培养3周后，形成的外生菌根结构如图1、2所示.与未接种双色蜡蘑的毛果杨幼苗相比，接种双色蜡蘑的毛果杨幼苗形成较多的侧根和菌根(图2A).菌根化毛果杨幼苗的主根不明显，侧根被双色蜡蘑菌丝包裹和缠绕，呈现褐色短小的菌根；
非菌根化杨树的主根较为明显，侧根较少，呈现乳白色；
侧根间有菌丝网和明显的菌根结构(图2B、2C).

2.2 毛果杨菌根的结构

图3A～3D和图3E～3H分别为20倍与40倍显微镜下的菌根切片图.图3A、3B为明场下的外生菌根横切片，内部排列致密的为杨树根细胞，外部为缠绕的真菌菌丝.由图3可知外生菌根形态完整.绿色为外生菌根真菌(图3B、3F)，红色为杨树根细胞(图3C、3G)，绿色的菌丝呈现丝状或空心圆圈状；
杨树根细胞普遍为椭圆状，排列齐整，但最外层细胞排列较内部根细胞松散，细胞间有菌丝伸入，有空隙.图3D、3H分别为488 nm和561 nm的叠加场图.通过WGA与PI染色，可同时观察到菌丝围绕在杨树根细胞周围，在根际周围形成菌套；
部分真菌菌丝进入杨树根细胞间并在杨树的表皮和皮质细胞之间形成哈氏网(图3D、3H).

A.双色蜡蘑菌丝MMN固体培养7 d；
B.双色蜡蘑菌丝MMN液体培养7 d；
C.在生根培养基中培养毛果杨幼苗2～3周；
D.石英砂加25 mL共培养液体培养基；
E.毛果杨幼苗和双色蜡蘑菌丝共培养；
F.共培养3周后进行检测.图1 毛果杨—双色蜡蘑外生菌根的体外培养体系Fig.1 Ectomycorrhizal culture system of P.trichocarpa -L.bicolor in vitro

A.毛果杨树根系生长形态；
B.显微镜下菌根化毛果杨根形态；
C.显微镜下非菌根化毛果杨根形态.图2 不同处理的毛果杨树根系生长形态图Fig.2 Morphology of P.trichocarpa root with or without L.bicolor inoculation

2.3 菌根化对毛果杨幼苗生长的影响

图4 不同处理对毛果杨生长状态的影响Fig.4 Effect of mycorrhization on the growth of P.trichocarpa

在菌根真菌的作用下，处理组(杨树与真菌共培养)的杨树幼苗较对照组(未添加真菌的共培养)具有更好的生长状态(图4).

共培养3周后发现，未添加真菌的毛果杨幼苗平均株高为(45.67±8.77) mm，外生菌根真菌共培养的毛果杨平均株高为(53.17±5.56) mm，菌根化的毛果杨幼苗的株高比未添加真菌的毛果杨提高了15.16%(图5A)；
未添加真菌的毛果杨幼苗鲜重为(412.15±59.49) mg，外生菌根真菌共培养的毛果杨鲜重为(620.92±57.43) mg，菌根化的毛果杨幼苗的鲜重比非菌根化毛果杨提高了50.65%(图5B).单因素方差分析结果表明，接种外生菌根真菌双色蜡蘑对毛果杨鲜重有显著影响(P=0.030)，对株高无显著影响(P=0.487).

A.杨树苗株高；
B.杨树苗鲜重.*表示具有显著性.图5 不同处理对毛果杨鲜重与株高的影响Fig.5 Effect of mycorrhization on fresh weight and plant height of P.trichocarpa

本研究以石英砂为基质，使用模式植物杨树与模式外生菌根真菌双色蜡蘑培养外生菌根，并观察到菌丝进入杨树根细胞间隙，形成了典型的哈氏网结构.通过测量生长3周的毛果杨幼苗的株高与鲜重，发现添加双色蜡蘑的毛果杨幼苗的株高与鲜重比未添加双色蜡蘑的分别增长15.16%与50.65%.表明外生菌根真菌能促进杨树生长，显著增加杨树的鲜重.