慢性HBV感染者外周血PNPLA3/PRKAA1基因多态性与肝硬化发生关系研究*

林秀慧，李 南，张娇珍，符庆忠，林秀华

肝硬化属于临床常见的慢性肝病，由多种原因导致肝组织呈弥漫性、进行性纤维化性病变[1]。我国肝硬化病因主要为病毒性肝炎、酒精中毒和脂肪性肝病等。由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持续感染造成肝组织炎症，致使肝小叶遭到破坏，形成假小叶或硬化性结节[2]。据调查显示[3]，在暴露于HBV感染的患者中，仅少数发展为肝硬化或肝癌。在慢性乙型肝炎患者中，约20%左右患者发生肝硬化，约5%患者持续感染后发展为肝癌。探讨感染HBV后肝硬化发生的易感因素，为预防肝硬化的发生寻找更为有效的方法，有利于缓解疾病导致的社会经济负担[4]。Patatin样磷脂酶结构域蛋白3(patatin-like phospholipase domain-containing protein 3，PNPLA3)基因位于染色体22q13.31，属Patatin样磷脂酶家族成员，编码一个肝细胞膜表达的跨膜蛋白，调节脂质代谢和炎症介质，与肝组织炎症和肝纤维化进展有关[5]。腺苷活化蛋白激酶α1亚基(protein kinase AMP-activated catalytic subunit α1，PRKAA1)位于常染色体5p13，编码活化AMP蛋白激酶 (adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK) 。AMPK在真核生物细胞中广泛表达，是一种重要的能量调节器，可准确感受细胞内AMP/ATP比值变化，激活自噬，参与细胞生长增殖等一系列生物学过程[6]。本研究探讨了PNPLA3/PRKAA1基因多态性与感染HBV后肝硬化发生的关系，旨在为肝硬化发生的机制研究提供理论依据，现报道如下。

1.1 一般资料 2016年1月～2021年7月我院诊治的乙型肝炎肝硬化患者101例，男65例，女36例；
年龄为41～75岁，平均年龄为(52.7±6.1)岁。符合《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[8]的诊断标准。肝硬化病程为1～10年，平均为(4.7±1.3)年；
肝功能Child-Pugh A级29例，B级39例，C级33例。排除标准：合并恶性肿瘤；
合并心、肺、肾、肠胃等其他脏器严重疾病；
药物性肝损伤、酒精性肝炎；
急性感染或外伤等应激状态；
重叠其他肝炎病毒感染。另选择同期慢性无症状HBV携带者90例，男59例，女31例；
年龄为40～74岁，平均年龄为(51.0±5.9)岁。入组对象签署知情同意书，本研究获得我院医学伦理委员会批准通过。

1.2 血浆PNPLA3/PRKAA1基因多态性检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法检测PNPLA3基因rs738409、rs139047、rs2294919和PRKAA1基因rs3792822、rs10036575、rs154268位点多态性。抽取静脉血4 mL，与EDTA混合。提取样本基因组(贝克曼AMPurea XPDNA血液基因组提取试剂盒)，用双蒸水溶解，在检测纯度合格后，置于-80℃保存。参照美国Sequenom公司提供的序列设计引物，引物合成由成都合成生物科技有限公司进行。PNPLA3基因：rs738409位点：F：5′-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCTGCTCACTTGGAGAAAG-3′，R：5′-AGGAAACAGCTATGACCATCTGCAGGCAGGAGATGTG-3′；
rs139047：F：5′-CAATGTCCACCAGCTCATCTC-3′，R：5′-CACAACACCATGCCTAGCTAAT-3′；
rs2294919位点：F：5′-ACGTTGGATGTCTGTGAGTCACTTGA-3′，R：5′-ACGTTGGATGCACTACACAGCAATGC-3′。PRKAA1基因：rs3792822位点：F：5′-CTATTTAATAACCAGTTCCCTTAGTCAT -3′，R：5′-AAGTCTGAGGATTATGAGTTCTGGG-3′；
rs10036575 位点：F：5′-GCAGACCCAGTAGTAGTAACCTGAAGAC-3′，R：5′-GCTACCCTGTAAGTTGCAGAATGATATA-3′；
rs154268：F：5′-CTATTACTTGTGGCAAAAAGCATCC -3′，R：5′-AGTCCAAGGATCATAGGTTTCATAGAT -3′。应用Sequenom MassAR-RAY 技术分型。(1)目的基因扩增：取适量基因组DNA，加入96孔板，取DNA (5 ng)、引物(各2.5 pmol)、Taq聚合酶(0.1 U)、10 mmol/L dNTP(0.5μL)。PCR扩增：93℃、15 min，95℃、30 s，55℃、30 s，74℃、45 s，循环40次，74℃、5 min。(2)SAP反应：以0.3 U碱性磷酸酶去除剩余的dNTP，35℃、40 min，84℃，5 min。(3)单碱基延伸：延伸引物5.4 pmol、50μmol ldNTP和ddNTP混合物、Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，94℃、2 min，94℃、5 s，55℃、5 s，74℃、5 s，循环35次；
72℃，3 min。(4)脱盐、上机：用树脂脱盐15 min，转移到SpectroCHIP芯片，行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件分析，计数资料以%表示，组间采用卡方检验；
应用Logistic回归分析疾病风险关联，P<0.05表示差异有统计学意义。

2.1 肝硬化组与HBV携带者血浆PNPLA3/PRKAA1基因型和基因频率分布比较 经拟合优度卡方检验，两组人群PNPLA3基因rs738409、rs139047、rs2294919和PRKAA1基因rs3792822、rs10036575、rs154268位点基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡定律(P>0.05)；
肝硬化组PNPLA3基因rs139047、rs2294919位点和PRKAA1基因rs3792822、rs154268位点等位基因和基因型频率与HBV携带者比，无显著性差异(P>0.05)；
肝硬化组PNPLA3基因rs738409位点GG基因型和等位基因G比率显著高于HBV携带者，PRKAA1基因rs10036575位点CC基因型和等位基因C比率显著高于HBV携带者(P<0.05，表1、表2)。

表1 肝硬化组与HBV携带者血浆PNPLA3基因型分布比较

表2 肝硬化与HBV携带者血浆PNPLA3基因频率分布比较

2.2 PNPLA3/PRKAA1基因型与感染HBV后肝硬化发生疾病风险关联分析 应用非条件Logistic回归模型计算校正性别、年龄后的OR及95%CI，结果显示PNPLA3基因rs738409位点GG基因型和PRKAA1基因rs10036575位点CC基因型是影响感染HBV后肝硬化发生的危险基因型(表3)。

表3 PNPLA3/PRKAA1基因型与感染HBV后肝硬化发生疾病风险关联分析

慢性HBV感染演变为肝硬化和肝癌的机制至今尚未阐明。国内外研究表明[9-11]，除病毒和环境因素之外，感染转归还与宿主遗传易感因素相关。不同个体遗传易感性对疾病发展结局造成重要的影响。

PNPLA3为跨膜蛋白，在人体主要表达于肝细胞，其次是皮肤、脂肪细胞，具脂肪酰化水解酶活性，其表达水平与饮食、体质量、胰岛素水平等相关，受到肝脏和脂肪组织的综合代谢调节[12，13]。近年来，PNPLA3基因多态性对肝病的作用引起了广泛的研究[14]。本研究观察了PNPLA3基因rs738409、rs139047、rs2294919位点基因多态性对HBV感染患者肝硬化发生的影响。rs738409位点编码PNPLA3蛋白148位氨基酸。研究表明[15]，rs738409G等位基因与乙型肝炎患者脂肪变、纤维化进展等相关。本研究显示肝硬化组PNPLA3基因rs738409位点GG基因型频率和G等位基因频率显著高于HBV携带者，经Logistic回归分析显示GG基因型是导致HBV感染患者肝硬化发生的独立危险因素。基因位点C→G转换使异亮氨酸转化成蛋氨酸，阻止底物结合到有催化活性的47位丝氨酸上，使其脂肪酰基水解活性丧失，导致体内甘油三酯蓄积，加速肝纤维化进程[16]。相关研究表明[17]，rs139047位点变异与HBV感染患者脂肪变相关，且其相关强度相较于rs738409位点更大。但本研究中肝硬化组rs139047位点基因分布无显著性差异，rs139047位点基因多态性不影响肝硬化发生风险。PNPLA3对感染HBV后肝硬化的发生影响机制较为复杂，众多基因参与其中，而单独基因的作用可能较小。本研究肝硬化组与HBV携带者rs2294919位点基因型分布比较无显著性差异，提示rs2294919位点基因多态性与肝硬化发生风险无关。

PRKAA1不仅仅是细胞内能量感受器和调节器，具有调节保守丝氨酸/苏氨酸激酶活性，能够调节机体能量平衡和代谢应激[18]。当机体AMP/ATP升高时，发生酶磷酸化，AMPK被激活，活化后的 AMPK促进分解代谢，生成ATP，抑制蛋白质、碳水化合物、脂质合成，恢复AMP/ATP 比率，保持机体能量代谢的平衡[19，20]。本研究分析了PRKAA1基因rs3792822、rs10036575 、rs154268位点基因多态性对HBV感染患者发生肝硬化的影响。rs3792822位点存在GG、GA和AA 基因型，肝硬化组与HBV携带者rs3792822位点基因型分布比较无显著差异，上述结果提示PRKAA1基因rs3792822位点基因多态性可能与 HBV相关的肝硬化易感性无关。本研究肝硬化组PNPLA3基因rs738409位点GG基因型和等位基因G比率分别为19.8%和44.6%，显著高于HBV携带者的8.9%和29.4%(P<0.05)，肝硬化组PRKAA1基因rs10036575位点CC基因型和等位基因C比率分别为38.6%和63.9%，显著高于HBV携带者的23.3%和45.5%(P<0.05)。经非条件Logistic回归模型分析显示PNPLA3基因rs738409位点GG基因型[OR为1.605(95%CI：1.150～2.239)]和PRKAA1基因rs10036575位点CC基因型[OR值为1.507((95%CI：1.097～2.070)]是影响感染HBV后肝硬化发生的危险基因型。本研究分析了PRKAA1基因rs154268位点多态性与HBV感染肝硬化发病风险的关系，结果显示rs154268位点基因多态性与肝硬化发生风险无关。这些结果均需要扩大验证。