华蟾素注射液抑制小鼠黑色素瘤的作用及机制研究

刘霞霞，陈 馨，王文君，程 卉，吴 欢

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；
2.教育部新安医学重点实验室，安徽 合肥 230038；
3.安徽中医药大学科研技术中心，安徽 合肥 230038)

黑色素瘤是一种具有强侵袭性的皮肤肿瘤。其发病率虽低，但恶性程度高、转移发生早、致死率高，占所有皮肤癌相关死亡病例的80%以上[1]。近年来，黑色素瘤患者不断增加，据估计2020年黑色素瘤新增癌症病例超过10万例[2]。在早期，手术切除肿瘤可获得良好的预后，然而，由于黑色素瘤的强侵袭性和转移能力，手术很少能延长晚期患者的生存时间。转移是导致黑色素瘤晚期患者死亡的主要原因之一。目前，针对黑色素瘤高侵袭性特点的药物有限，且临床上治疗癌症的有效化学治疗药物具有严重的毒性和不良反应。因此，寻找毒性和不良反应小且能有效抑制黑色素瘤生长和转移的药物迫在眉睫。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal trans-formation，EMT)指上皮细胞通过一定的程序转化成间质细胞，这一过程使细胞具有转移和侵袭的能力。黑色素瘤的转移侵袭能力与EMT密切相关。EMT首先涉及细胞骨架的重组，使肿瘤发生侵袭和转移成为可能[3]。越来越多的证据表明，在EMT期间，与细胞骨架相互作用的蛋白，如上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)下调，而间充质标志物，如Vimentin和神经钙黏蛋白(nervous cadherin,N-cadherin)表达上调[4]。此外，在EMT的最后阶段，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等蛋白酶的表达使基膜和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解增加[5]。EMT过程中黑色素瘤细胞的黏附性减弱，形态更像间充质细胞，有利于癌细胞的侵袭，向体内不同微环境迁移，形成转移。

华蟾素是中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍干燥表皮的水煎煮提取物，具有清热解毒、消肿止痛的功效。华蟾素注射液是华蟾素在临床上使用较为广泛的一种制剂，其多种有效成分在体内可发挥作用[6]。研究[7-10]表明，华蟾素注射液对胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌等恶性肿瘤有较好的抑制作用。华蟾素可通过抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、抗肿瘤血管生成、调控免疫应答等多种途径发挥抗肿瘤作用[11-12]，但华蟾素对黑色素瘤的作用及其机制尚未明确。因此，本研究以黑色素瘤移植瘤小鼠为研究对象，初步探讨华蟾素注射液对黑色素瘤移植瘤小鼠的作用及其机制，为华蟾素注射液应用于临床治疗黑色素瘤提供一定的实验依据。

1.1 细胞株 黑色素瘤细胞B16F10购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药品与试剂 华蟾素注射液(批号 191204-2)：安徽华润金蟾药业有限公司；
RPMI-1640培养基(GP21040160382)、抗Vimentin抗体(GB12192)：武汉赛维尔生物科技有限公司；
胎牛血清(2177370)：美国Gibco公司；
青霉素-链霉素溶液(批号 080421211018)：江苏碧云天生物技术有限公司；
抗Ki67抗体(ab15580)：Abcam；
抗MMP-2抗体(bs-4599R)、抗MMP-9抗体(bs-0397R)：Bioss；

抗E-cadherin抗体(14472)、N-cadherin抗体(Cell Signaling Technology,14215)：美国CST公司。

1.3 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体质量18～22 g，购于杭州子源实验动物中心[生产许可证号：SCXK(浙)2019-0004]。小鼠经预适应1周后进行后续实验，实验室湿度为(55±10)%，温度为(20±0.5)℃，明暗周期为12 h/12 h。研究方案经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准(动物伦理编号：AHUCM-mouse-2021062)。

1.4 仪器 CO2培养箱：美墨尔特贸易有限公司；
-80 ℃冰箱：日本Sanyo公司；
Olympus CKX41型倒置显微镜：日本Olympus公司；
BSC-1000Ⅱ A2型生物安全柜：浙江苏净净化设备有限公司；
灭菌锅：日本Hirayama公司；
ZT-12M型自动脱水机：孝感市亚光医用电子科技有限公司；
YB-7B型石蜡包埋机：孝感市亚光医用电子技术有限公司；
科力飞切片漂烘仪：安徽电子科学研究所；
RM2135型Leica切片机：德国徕卡仪器有限公司；
HIETECH数字切片扫描仪：济南丹吉尔电子有限公司；
165-8001 Mini-Protean Tetra型电泳仪、电泳槽：美国Bio-Rad公司；
Gel View 6000 Plus凝胶成像系统：广州博鹭腾生物技术有限公司。

2.1 黑色素瘤移植瘤模型的复制 取生长状态良好的B16F10细胞，调整细胞密度为2×107/mL，每只C57BL/6小鼠右侧腋下接种100 μL细胞悬液。

2.2 动物分组及给药 模型复制后小鼠腋下注射细胞部位出现米粒大小的包块表明模型复制成功，将模型复制成功后的小鼠随机分成对照组，华蟾素注射液低、中、高剂量组，每组10只。华蟾素注射液低、中、高剂量组小鼠分别被腹腔注射156、312、468 mg/mL华蟾素注射液，注射容积均为0.15 mL，连续15 d；
对照组小鼠被腹腔注射0.15 mL生理盐水。实验过程中，隔日称量小鼠体质量1次，第16天用10%乌拉坦麻醉小鼠后，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖剥离瘤体并称质量。

2.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察移植瘤的组织形态 取出各组固定在4%多聚甲醛磷酸缓冲液的黑色素瘤体，先用浓度梯度递增的乙醇进行脱水，然后用二甲苯进行透明，最后利用石蜡对瘤体包埋后做切片，片厚为4 μm，对移植瘤组织进行HE染色。光学显微镜下观察黑色素瘤移植瘤的组织形态。

2.4 免疫组织化学法检测Ki-67、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9表达水平 将取出的各组黑色素瘤体的石蜡切片进行脱蜡和水化处理后，再用抗原修复，之后加入3%过氧化氢溶液除去内源性过氧化氢酶，再滴加3% BSA进行封闭，取出，置于相应的一抗中，于4 ℃环境下孵育过夜。二抗室温孵育50 min后，加入DAB显色，最后用苏木精复染后进行脱水封片。

采用Image J软件测定免疫组织化学染色照片的平均光密度值，计算阳性蛋白的相对表达水平。

2.5 Western blot法检测蛋白表达水平 将冻存在-80 ℃冰箱中的黑色素瘤组织取出，放置在冰上，取出一小部分组织，置于研磨器中，加入含有磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，充分研磨裂解，超声破碎，-4 ℃离心(12 000 r/min)20 min，收集上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，用裂解液将蛋白浓度稀释配平至20 μg/mL，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸。用10%聚丙烯酰胺凝胶将蛋白电泳分离，冰浴，湿转，将蛋白转至NC膜，用体积分数为5%的脱脂牛奶室温封闭，TBST洗膜3次，将不同蛋白区域剪开，分别加入一抗稀释液的Vimentin(稀释度1∶1 000)、N-cadherin(稀释度1∶1 000)、MMP-9(稀释度1∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，用相应二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次后用化学发光液进行条带曝光。采用Image J软件测定条带的灰度值，计算蛋白的相对表达水平，以β-actin为内参。

3.1 4组小鼠黑色素瘤移植瘤质量比较 与对照组比较，华蟾素注射液低、中、高剂量组小鼠黑色素瘤移植瘤质量均显著降低(P<0.05)，华蟾素注射液高剂量组小鼠移植瘤质量最低。见图1。

注：A.对照组；
B.华蟾素注射液低剂量组；
C.华蟾素注射液中剂量组；
D.华蟾素注射液高剂量组；
与对照组比较，*P<0.05

3.2 不同时点4组小鼠体质量比较 小鼠腋下移植黑色素瘤细胞B16F10后第11天开始，对照组小鼠体质量逐渐降低，至移植术后第15天，对照组小鼠体质量显著低于华蟾素注射液低、中、高剂量组；
各时点华蟾素注射液高剂量组小鼠体质量高于华蟾素注射液中、低剂量组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05

3.3 华蟾素注射液对黑色素瘤移植瘤组织形态的影响 对照组小鼠移植瘤细胞具有明显的黑色素瘤的组织形态特征，胞浆边界清楚、呈玻璃样，细胞核偏置，核仁突出，黑色素瘤细胞可以是多形性的，呈上皮样、成角、小而圆；
病变中黑色素细胞真皮处可形成巢，细胞密度增加。而华蟾素注射液低、中、高剂量组小鼠移植瘤中黑色素细胞形成的巢较少见，细胞密度降低，细胞体积较对照组增大，细胞核深染现象得到缓解。见图3。

注：A.对照组；
B.华蟾素注射液低剂量组；
C.华蟾素注射液中剂量组；
D.华蟾素注射液高剂量组

3.4 4组小鼠移植瘤组织中Ki-67蛋白表达水平比较 免疫组织化学染色结果显示，黑色素瘤细胞的细胞核若无染色或淡黄色则表示Ki-67蛋白低表达，若染色为黄褐色或棕色则表示Ki-67蛋白高表达。与对照组比较，华蟾素注射液中、高剂量组小鼠黑色素瘤移植瘤中Ki-67蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图4、图5。

注：A.对照组；
B.华蟾素注射液低剂量组；
C.华蟾素注射液中剂量组；
D.华蟾素注射液高剂量组

注：A.对照组；
B.华蟾素注射液低剂量组；
C.华蟾素注射液中剂量组；
D.华蟾素注射液高剂量组；
与对照组比较，*P<0.05

3.5 4组小鼠移植瘤组织迁移相关蛋白表达水平比较 免疫组织化学染色结果显示，棕褐色越深表明蛋白表达水平越高。与对照组比较，华蟾素注射液中、高剂量组E-cadherin蛋白表达水平显著上升(P<0.05)，华蟾素注射液低、中、高剂量组N-cad-herin、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；
华蟾素注射液中、高剂量组MMP-2、Vimentin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图6、图7。Western blot检测结果显示，华蟾素注射液低、中、高剂量组移植瘤中N-cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图8、图9。

图6 4组小鼠移植瘤中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的免疫组织化学染色结果(10×20倍)

图7 4组小鼠移植瘤中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平比较

注：A.对照组；
B.华蟾素注射液低剂量组；
C.华蟾素注射液中剂量组；
D.华蟾素注射液高剂量组

注：与对照组比较，*P<0.05

黑色素瘤是一种转移能力极强、病死率极高的皮肤恶性肿瘤，严重危害人类健康。转移是恶性肿瘤较为显著的特征之一，肿瘤细胞一方面可以在原发部位生长，另一方面能够通过多种途径蔓延、扩散、定植到其他部位。在黑色素瘤的特征中，高侵袭性是阻碍黑色素瘤治疗的关键。因此，抑制肿瘤的转移和增殖能力是治疗肿瘤的基本途径之一。

EMT在许多癌症生物学行为中起着至关重要的作用，如肿瘤的迁移和侵袭，抑制EMT的发生能够抑制肿瘤的侵袭和转移[13]。有关侵袭性MMPs的研究表明，MMPs在肿瘤转移中具有重要的作用，其中MMP-2和MMP-9与恶性肿瘤的远处播散密切相关。MMPs通过分解基底膜蛋白，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，被认为是癌症细胞侵袭的重要促进因子。黑色素瘤细胞在转移之前通常会经历EMT，这使得肿瘤细胞更容易发生迁移和侵袭。Vimentin是中间纤维蛋白最主要的组成成分，与微管、微丝共同构成细胞骨架，参与调控细胞黏附、细胞形状变化和迁移速度。N-cadherin是一种黏附分子，主要介导细胞与细胞间的动态黏附。N-cadherin表达上调可增强多种上皮癌细胞在体外的迁移和侵袭能力。EMT的发生伴随着一系列变化，细胞会抑制一些上皮细胞黏附分子，如E-cadherin的表达水平降低，而增加间充质细胞黏附分子如Vimentin的表达水平，获得迁移和侵袭能力[14]。黑色素瘤细胞的增殖能力也影响着肿瘤的治疗。Ki-67蛋白是一种半衰期短的非组蛋白核蛋白，是临床上检测肿瘤细胞增殖活性的常见指标。此外，邢芳林等[15]研究认为，Ki-67蛋白的表达水平能够反映患者恶性肿瘤增殖率，其高表达与患者的不良预后密切相关，能一定程度上反映肿瘤进展[16]。

本研究发现，华蟾素注射液可以缓解黑色素瘤移植瘤对小鼠造成的功能损伤，可抑制黑色素瘤移植瘤质量的增加，光学显微镜下发现华蟾素注射液组移植瘤的组织形态特征发生明显变化，结果说明华蟾素注射液可以抑制移植瘤的生长。通过对移植瘤组织Ki-67蛋白表达情况的研究，发现华蟾素注射液可抑制黑色素瘤细胞的增殖能力，但其是否与抑制黑色素瘤的高侵袭性有关还有待进一步研究。免疫组织化学和Western blot实验结果显示，华蟾素注射液组可上调黑色素瘤移植瘤中E-cadherin蛋白的表达水平，这有助于维持细胞连接而抑制间充质蛋白的表达；
可下调Vimentin和N-cadherin蛋白的表达水平，从而抑制细胞与纤维连接蛋白的黏附而抑制EMT进程[17]；
可降低MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平，从而抑制ECM蛋白降解和细胞侵袭而抑制EMT的发生。以上结果表明，华蟾素注射液可通过抑制黑色素瘤移植瘤EMT的发生，抑制黑色素瘤的增殖以及转移能力，但其具体分子机制仍有待进一步阐明。

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