响应面法优化地皮菜总三萜提取工艺及其抗氧化活性

宋晓凡，李岩，院珍珍，2*，马馥梅

（1.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016；
2.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016）

地皮菜（Nostoc commune）又称为地软、地木耳等，一般出现在干旱、半干旱的地区，是一种重要的固氮原核生物，在青海省柴达木盆地的德令哈、格尔木、都兰、天峻等地均有大面积生长[1]。据中国药典记载，地皮菜对补充维生素和蛋白质、清热解毒、滋阴润肺、益气明目、皮疹赤热等具有明显效果[2]，而且含有缩酚类、单取代苯环类、蒽醌类、三萜类以及多糖等多种活性成分[3]。同时地皮菜中的活性成分具有保湿、紫外线防护等多种护肤功效[4-5]。因此，研究地皮菜中活性成分对其产品开发和综合利用具有重要意义。

三萜类化合物是一类由多个异戊二烯单位（C5H8）构成的烃类及其含氧衍生物，通常是由30个碳原子组成[6]。三萜类化合物具有抗炎[7]、抗肿瘤[8]、免疫[9]等生物活性，因此有很多关于灵芝[10]、牛樟芝[11]等的总三萜提取工艺的研究报道。目前，地皮菜水溶性多糖、黄酮的提取及结构特征和生物活性是研究的热点，但是对地皮菜中总三萜的提取及其抗氧化分析的相关研究较少。地皮菜含有多种活性成分，具有重要的食用和药用价值，开发应用前景广泛。

目前提取三萜的方法有传统热提取、索氏提取[12]、微波辅助提取[13-14]、超临界辅助萃取[15]、超声波辅助提取[16-17]等，超声波辅助提取方法操作简便，用时较短，深受研究者的青睐。本试验对地皮菜总三萜超声波辅助提取工艺进行优化，并探究其抗氧化活性，以期为地皮菜资源的研究和进一步开发利用提供参考。

1.1 材料与试剂

青海野生地皮菜：海东市绿品源商贸有限公司；
齐墩果酸、2，2"-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2"-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
95%乙醇、甲醇、冰乙酸：天津市富宇精细化工有限公司；
高氯酸：北京化工厂；
三氯乙酸、邻苯三酚：天津市百世化工有限公司；
香草醛：上海中秦化学试剂有限公司；
以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

200T多功能粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；
R-1001VN旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；
SB-3200DTD超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；
UV-2600紫外可见分光光度计：日本岛津公司；
H/T16MM台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 地皮菜总三萜的提取

将地皮菜洗净烘干后，粉碎过60目筛备用。精确称取地皮菜粉末，与一定量乙醇溶液混合，在一定的温度下以320 W的功率超声处理一定时间，抽滤除去废渣，旋转蒸发浓缩，将浓缩液烘干，得到地皮菜总三萜粗提取物。

1.3.2 标准曲线的绘制

称取齐墩果酸4 mg，用甲醇溶解后置于10 mL容量瓶中定容，分别移取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 上述标准液置于10 mL的容量瓶中，水浴加热15 min后依次加入0.4 mL 5%的香草醛-冰乙酸溶液和1 mL高氯酸，在60℃水浴加热30 min后用流水冷却至室温，加冰乙酸定容，于550 nm处测定吸光值，利用吸光值和标准品的质量浓度绘制标准曲线[18]，得到线性回归方程 y=2.370 9x+0.006 2，R2=0.999 1。

1.3.3 总三萜得率的计算

称取一定量总三萜粗提取物，用乙醇将其溶解。在试管中加入配好的总三萜溶液1.0 mL，按1.3.2方法测定3次，测得的吸光值（A）取平均值代入1.3.2回归方程计算地皮菜总三萜质量浓度。根据公式（1）计算地皮菜总三萜得率。

式中：W为地皮菜总三萜得率，%；
C为计算得到的总三萜质量浓度，mg/mL；
V为待测总三萜溶液体积，mL；
D为稀释倍数；
M为地皮菜样品质量，mg。

1.3.4 单因素试验

固定提取温度65℃、提取时间40 min、乙醇浓度75%、料液比1∶25（g/mL）中的3个因素，进行单因素试验。分别改变提取温度（55、60、65、70、75 ℃）、料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、提取时间（20、30、40、50、60 min） 和乙醇浓度（55%、65%、75%、85%、95%），考察各因素对地皮菜总三萜得率的影响。

1.3.5 响应面试验

根据单因素试验结果，进行三因素三水平的响应面优化试验。固定乙醇浓度为95%，考察料液比、提取时间以及提取温度对地皮菜总三萜得率的影响。利用Design-Expert软件对数据进行拟合，确定最优提取工艺。试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of response surface test design

1.3.6 抗氧化活性测定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力测定参考Zhang等[19]的测定方法并作修改。取不同浓度的样品加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL混匀，室温避光反应30 min，于517 nm处检测其吸光值A1。同条件下测定DPPH溶液的吸光值A0。以VC为阳性对照。按照公式（2）计算DPPH自由基清除率，平行测定3次。

1.3.6.2 ABTS+自由基清除能力测定

ABTS+自由基清除能力测定参考Liu等[20]的方法并有所改动。将7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1∶1混合，在黑暗、室温下放置16 h；
用磷酸盐缓冲液（pH7.0）稀释混合液至其吸光值在734 nm处为0.70±0.02，得到ABTS混合溶液。将不同浓度的样品以1∶20的体积比加入到ABTS混合溶液中，混合后于室温下孵育6 min，于734 nm处测定吸光值A1。同条件测定ABTS混合溶液的吸光值A0。以VC为阳性对照。ABTS+自由基清除率按公式（3）计算，平行测定3次。

1.3.6.3 羟自由基清除能力测定

参考张美萍等[21]的方法略有改动。取0.15 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.4）和0.04 mg/mL的番红溶液各1 mL，0.945 mmol/L 的 EDTA-2Na-Fe2+溶液（pH7.4）0.5 mL、再加入0.5 mL不同浓度的样品和1%H2O2溶液0.5 mL，于37℃孵育30 min，在520 nm下检测吸光值A1。同条件测定超纯水吸光值A0。以VC为阳性对照。按照公式（4）计算羟自由基清除率，平行测定3次。

1.3.6.4 总还原能力测定

参考康宁等[22]的方法略有改动。取2.5 mL不同浓度的样品液，依此加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，置于50℃水浴反应20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混合后以3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5mL0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10min，在700 nm处测定吸光值。以VC作为阳性对照。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，采用SPSS 26.0软件进行数据分析，作图采用EXCEL 2016软件。

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对地皮菜总三萜得率的影响

提取温度对地皮菜总三萜得率的影响见图1。

图1 提取温度对地皮菜总三萜得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

图1表明，地皮菜总三萜得率随提取温度升高呈先上升后下降趋势，总三萜得率在60℃时达到最大值，为0.96%。随着提取温度的继续升高，总三萜得率降低，可能是因为随着提取温度的升高，提取温度越接近乙醇沸点78℃，致使乙醇挥发速度加快，导致总三萜得率减小。因此，选取提取温度为55、60、65℃进行后续试验。

2.1.2 料液比对地皮菜总三萜得率的影响

料液比对地皮菜总三萜得率的影响见图2。

图2 料液比对地皮菜总三萜得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

由图 2 可知，当料液比为 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）时，地皮菜总三萜得率随溶剂量的增加而增加，这说明溶剂量过少导致总三萜溶解不完全，从而总三萜得率较低。在料液比为1∶20（g/mL）时得率最高，为0.85%，随后总三萜得率随溶剂量增大呈现下降的趋势，可能是稀释倍数过大，且溶剂乙醇在加热条件下更易挥发，从而导致总三萜得率下降。因此，选取料液比为1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）进行后续试验。

2.1.3 提取时间对地皮菜总三萜得率的影响

提取时间对地皮菜总三萜得率的影响见图3。

图3 提取时间对地皮菜总三萜得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

由图3可知，地皮菜总三萜得率随着提取时间的延长先升高后降低，当提取时间为50 min时得率达到峰值，为0.59%。分析原因可能是提取时间过长破坏了总三萜的结构，导致总三萜得率降低。因此，选取提取时间为40、50、60 min进行后续试验。

2.1.4 乙醇浓度对地皮菜总三萜得率的影响

乙醇浓度对地皮菜总三萜得率的影响见图4。

图4 乙醇浓度对地皮菜总三萜得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

由图4可知，总三萜得率随着乙醇浓度的增大而逐渐升高，当乙醇浓度为95%时，总三萜得率为1.1%。分析原因可能是地皮菜中含有的总三萜易溶于乙醇等有机溶液，而较难溶于水，所以乙醇的浓度越高，溶出的总三萜就越多。因此确定最佳的乙醇浓度为95%。

2.2 响应面优化及分析

2.2.1 模型的建立与方差分析

响应面分析结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

表3 总三萜提取得率方差分析表Table3 Variance analysis table of total triterpenoid extraction ratio

对表2试验数据利用Design-Expert软件进行多元回归拟合，得到总三萜得率与提取温度、料液比、提取时间的二次多项回归模型：Y=1.41+0.015A+0.013B+0.062C+5.000×10-3AB+0.065AC+0.000BC-0.30A2-0.29B2-0.34C2。

由表3分析可知，该模型的F值为9.33且P＜0.01，表明拟合模型具有极显著性。根据F值可以得到3个因素对总三萜得率的影响大小顺序为C＞A＞B，即提取时间＞提取温度＞料液比。另外，A2、B2、C2对地皮菜总三萜得率的影响极显著，AB、AC、BC对总三萜得率的影响不显著，因此试验因素对响应值Y的影响不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大影响。以上均说明该模型可用于优化地皮菜总三萜提取工艺。

2.2.2 最佳提取工艺条件的验证

响应面试验分析得出地皮菜总三萜的最佳提取工艺条件：料液比 1∶20.11（g/mL），提取时间 50.94 min，提取温度60.18℃，预测在该条件下总三萜得率为1.41%。考虑到实际操作的可行性，将试验条件调整为料液比 1∶20（g/mL），提取时间 50 min，提取温度 60 ℃。重复3次试验进行验证，所得平均得率为1.38%，该结果与理论值接近，说明所得最优工艺参数准确可靠，表明该模型可以较好地预测地皮菜总三萜得率。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

地皮菜总三萜和VC对DPPH自由基的清除能力见图5。

图5 地皮菜总三萜和VC对DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由图5可知，当地皮菜总三萜的质量浓度在0.05 mg/mL～1.60 mg/mL时，地皮菜总三萜对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加保持不断增加的趋势。当质量浓度为1.60 mg/mL时，总三萜对DPPH自由基清除率达到最大，为48.43%。说明地皮菜总三萜具有一定的DPPH自由基清除能力，但是与VC相比较，DPPH自由基清除能力相对较弱。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

地皮菜总三萜和VC对ABTS+自由基的清除能力见图6。

图6 地皮菜总三萜和VC对ABTS+自由基的清除能力Fig.6 ABTS+free radical scavenging ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由图6可知，当质量浓度在0.05mg/mL～3.20mg/mL时，地皮菜总三萜对ABTS+自由基的清除能力与其质量浓度呈正相关。地皮菜总三萜的ABTS+自由基清除率从14.24%增加到81.43%，增加幅度较大。当质量浓度在3.20 mg/mL时，地皮菜总三萜的ABTS+自由基清除率接近VC。

2.3.3 羟自由基清除能力

地皮菜总三萜和VC对羟自由基的清除能力见图7。

图7 地皮菜总三萜和VC对羟自由基的清除能力Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由图7可知，当地皮菜总三萜的质量浓度为0.05 mg/mL～1.60 mg/mL时，地皮菜总三萜对羟自由基的清除率随质量浓度的增加无明显变化，且始终大于VC。当质量浓度为3.20 mg/mL时，地皮菜总三萜对羟自由基的清除率有了明显提高，但小于VC，表明地皮菜总三萜清除羟自由基的能力较强。

2.3.4 总还原能力

地皮菜总三萜和VC的总还原能力见图8。

图8 地皮菜总三萜和VC的总还原能力Fig.8 Total reducing ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由图8可知，当质量浓度在0.05mg/mL～3.20mg/mL时，随着质量浓度的增加，地皮菜总三萜的总还原能力呈先缓慢上升后急剧上升的趋势。当质量浓度为3.20 mg/mL时，地皮菜总三萜的总还原能力达到最大，为1.818，此时VC为2.566。相同质量浓度下，地皮菜总三萜的总还原能力低于VC的总还原能力。

本试验在单因素试验的基础上，采用响应面法优化地皮菜总三萜的超声辅助提取工艺条件，最终确定地皮菜总三萜的最佳提取条件为乙醇浓度95%、料液比 1∶20（g/mL）、提取时间 50 min、提取温度 60 ℃，在此最佳提取条件下得到地皮菜总三萜得率为1.38%。通过抗氧化试验可知，地皮菜总三萜具有一定DPPH自由基清除能力，对羟自由基、ABTS+自由基有较强的清除能力并且有较强的总还原能力。甚至当地皮菜总三萜浓度为3.20 mg/mL时，对羟自由基的清除率高于VC。可见，地皮菜总三萜具有较好的抗氧化活性，可作为天然的抗氧化剂进行开发利用。