虾皮酱加工过程中脂质氧化及抗氧化研究

卢逸夫，王灵昭，钱亮亮，高文清，曹荣

（1.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；
2.连云港市质量技术综合检验检测中心，江苏 连云港 222006；
3.味芳楼食品（江苏）有限公司，江苏 连云港 222346；
4.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071）

毛虾，个体小，长3 cm左右，在中国沿岸的水域中均有分布，平均每年捕获量为38万t，大约占全世界虾种平均捕获量的30%以上，远超过世界其他地区任何种类的虾。但因毛虾体积小、虾壳薄、虾肉少，不利于产品的保鲜，所以捕捞之后必须迅速运上岸，在工厂中进行加工。虾皮是毛虾的干制品，虾皮酱是以虾皮为主要原料，经相应工序加工制成的水产调味酱。水产加工品的脂质氧化程度是决定产品品质及货架期的重要因素，受脂肪酸组成、加工方式、水分、内源脂肪酶、金属离子、光线等诸多因素影响[1-2]。虾皮中的不饱和脂肪酸在加工过程中极易受到自身和环境的影响[3]，导致产品的风味、色泽乃至营养价值都发生巨大变化[4]。而且，虾皮中含有丰富的微量金属元素，在加工及储藏过程中极易诱发、催化脂质氧化反应[5]。本文所述的虾皮酱为含油型半固态调味料，总脂含量高。含油型半固态调味料的部分标准，对于产品脂质氧化指标存在一定要求，如：辣椒酱要求酸价≤4.0 mg/g；
芝麻酱要求酸价≤4.0 mg/g、过氧化值≤0.25 g/100 g；
花生酱要求酸价≤3.0 mg/g、过氧化值≤0.25 g/100 g。地方标准DB11/516—2008《半固态（酱）调味品卫生要求》和部分企业标准Q/HCYS 0001 S—2019《半固态复合调味料（含油型）》、Q/YJX 0002 S—2021《半固态调味料（含油型）》也对该类产品的酸价和过氧化值做出要求。因此，对于虾皮酱加工过程中脂质氧化及抗氧化进行研究具有现实意义。添加抗氧化剂是抑制脂质氧化及延长产品货架期的有效途径[6]。虽然天然抗氧化剂在食品中的抗氧化效果略逊于化学合成抗氧化剂，但是安全性高，更容易被消费者接受[7-9]。有研究表明，复合抗氧化剂的抗氧化能力显著高于单一抗氧化剂的抗氧化能力[10]，几种天然抗氧化剂的复配抗氧化效果甚至和化学合成抗氧化剂的抗氧化效果相当[11-13]。因此，本文在研究虾皮酱加工过程中的脂质变化基础上，研究天然抗氧化剂在虾皮酱中的应用，以期为虾皮酱产品的生产提供技术指导。

1.1 材料与试剂

虾皮：市售；
迷迭香：上海誉鑫食品添加剂商行；
乙二胺四乙酸二钠（disodium EDTA，EDTA-2Na）：青岛大伟生物工程有限公司；
维生素 E（vitamin E，VE）：山东鲁维制药有限公司。以上均为食品级。

总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒：南京建成科技有限公司；
盐酸、乙醇、石油醚、碘化钾、三氯乙酸、异丙醇、乙醚、碱性蓝6B、无水硫酸钠、三氯甲烷、氢氧化钾、硫代硫酸钠、可溶性淀粉（均为分析纯）、硫代巴比妥酸（98.5%）：国药集团化学试剂有限公司；
冰乙酸（分析纯）、1，1，3，3-四乙氧基丙烷（97%）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

四孔式数显恒温水浴锅（HH-4）：上海维城仪器有限公司；
电热鼓风干燥箱（101-3）：上海阳光实验仪器有限公司；
双光束紫外可见分光光度计（T9CS）：北京普析通用仪器有限责任公司；
数显水浴恒温振荡器（SHA-CA）：金坛市维诚实验器材厂；
离心机（HS-F16/3）：赛默飞世尔科技公司；
真空旋转蒸发器（R-210）：瑞士步琦有限公司；
冰箱（BCD-452WDPF）：青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 虾皮酱的制备

虾皮酱的制备如图1所示。

图1 虾皮酱的制备Fig.1 Preparation of shrimp skin paste

选取新鲜虾皮，去杂筛选后经油炸（130℃、10 min左右），炸至金黄色后滤油冷却至室温备用。油温120℃时，将配料和虾皮按照一定的比例混合、炒制，炒制20 min左右后降温，物料降至室温后加入抗氧化剂，搅拌混匀，后经杀菌（80℃、30 min）、冷却、包装，即得成品。

1.3.2 产品加工过程的脂质变化

参照孙甜甜等[14]的方法进行样品处理：分别称取100 g油炸前虾皮、油炸后虾皮、炒制用混料、灌装用物料、杀菌后物料，匀浆，加入 200 mL 氯仿/甲醇（2∶1，体积比）溶液进行搅拌、浸提4 h（25℃），过滤并用少量溶液冲洗滤渣，合并滤液后加入35 mL的0.9%氯化钠溶液，振荡摇匀后静置过夜，溶液明显分层后收集下层氯仿层，通过无水硫酸钠脱水后移至旋蒸瓶中，于40℃下真空旋蒸后得到待测油脂。测定样品总脂含量、甘油三酯含量、胆固醇含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、酸价和过氧化值。

1.3.3 不同抗氧化剂对虾皮酱脂质氧化的影响

根据GB2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》，选择迷迭香、EDTA-2Na和VE为抗氧化剂。在降温工序中分别加入不同浓度的迷迭香（0、0.030、0.090、0.150、0.225、0.300 g/kg）、EDTA-2Na（0、0.007 5、0.022 5、0.037 5、0.056 3、0.075 0 g/kg）和VE（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg），然后对灌装后物料进行加速氧化试验，研究不同抗氧化剂对虾皮酱脂质氧化的影响。

加速氧化试验采用Schaal烘箱加速氧化法[15]：将样品密闭于碘量瓶中，置于烘箱（60±1）℃中加速氧化，每隔8 h摇匀样品并随机交换位置。样品加速氧化5 d后分析酸价（acid value，AV）、过氧化值（pero xide value，POV）。

1.3.4 抗氧化剂复配研究

将迷迭香、EDTA-2Na和VE3种抗氧化剂按照GB 2760—2014的使用原则进行复配。以迷迭香浓度（A）、EDTA-2Na浓度（B）、维生素E浓度（C）为考察因素，利用Design-Expert 11软件的Box-Benhken进行试验方案设计，如表1所示。按照各方案配制不同样品，用超声波辅助样品溶解，将样品置于密封玻璃瓶中备用。采用加速氧化试验分析灌装后物料的酸价和过氧化值。

表1 复配抗氧化剂试验方案Table 1 Experiment scheme of compound antioxidant

1.3.5 复配抗氧化剂优选及验证

通过Design-Expert 11软件可以预测到不同方案的复配抗氧化剂。结合不同复配抗氧化剂的效果预测、经济成本、虾皮酱实际生产需要，挑选出3组较优的配方进一步优选、验证。

1.3.6 指标测定

总脂测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》的酸水解法；
丙二醛含量测定参考GB 5009.181—2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》的分光光度法；
酸价测定参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》的冷溶剂指示剂滴定法；
过氧化值测定参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》的滴定法。取一定量的样品中提取的总脂，分别用无水乙醇稀释，浓度为1∶9（g/mL），采用试剂盒法分析样品的总胆固醇、甘油三脂含量。

1.4 数据处理

数据以平均值±标准差表示（n=3）；
采用Excel、IBM SPSS Statistics 20、Origin 2018 及 Design Expert 11等软件处理和分析数据。

2.1 产品加工过程的脂质变化

在虾皮酱加工的5个关键流程中分别取样，研究加工过程中虾皮酱脂质指标的变化，结果如表2所示。

表2 虾皮酱加工过程中脂质变化Table 2 Lipid changes of shrimp skin paste during processing

由表2可知，各样品的总脂含量均有显著性差异（P＜0.05）。杀菌后物料的总脂含量高达43.89 g/100g，这说明研究虾皮酱加工过程中的脂质氧化及抗氧化具有现实意义。油炸前虾皮的总脂含量为3.35 g/100 g，油炸过后达到60.43 g/100 g，加工过程中因加入配料使得总脂含量显著降低（P＜0.05）。杀菌后物料总脂含量显著性下降（P＜0.05），可能因为产品杀菌过程促进了脂肪氧化，且由于水解和热氧化的作用产生的游离脂肪酸或过氧化物分解产生了醇、羟基酸和酸类等小分子物质，这与Sioen等[16]的研究结果一致。

虾皮本身几乎不含甘油三酯（TG），产品中的TG主要源于大豆油及配料。各样品的TG含量均有显著性差异（P＜0.05），在各取样点呈现时高时低现象，主要原因是与配料及不同工序有关。虾皮胆固醇（TC）含量在油炸后均显著降低（P＜0.05），油炸过程中胆固醇会流失于油炸用油，此外配料的添加会稀释样品的TC含量。物料在炒制、杀菌等加热过程中配料（如洋葱、大蒜、葱等）的脱水会产生水分的蒸气蒸馏作用，且各原辅料料之间会产生成分交换，此外动物油脂中的胆固醇在高温下会被氧化，生成对人体有害的羰基胆固醇[17]，这些原因会导致物料中TG和TC变化。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化物分解产物的一种，具有细胞毒性，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，其含量可反映油脂过氧化程度[18-19]。油炸后虾皮MDA含量由0.382 mg/kg显著地降低到0.145 mg/kg（P＜0.05），原因在于油炸过程中虾皮和大豆油之间的成分交换以及热处理过程中小分子化合物的蒸馏蒸发。炒制导致物料的MDA含量从0.240 mg/kg显著地升高到0.604 mg/kg（P＜0.05），这说明炒制过程中热作用以及物料成分之间的相互作用导致脂肪氧化产生的过氧化物会逐步分解生成低级的醛、酮、醇、羧酸及杂环化合物等[20]，MDA含量显著升高[21]。杀菌处理导致MDA含量的升高不显著（P＜0.05），这可能与杀菌前对物料的排气以及杀菌强度有关。

酸价（AV）和过氧化值（POV）是反应脂质氧化程度，判断脂质品质的重要指标[22]。AV体现了油脂中游离羧酸基团的量，其数值的大小与油脂中所含游离脂肪酸量多少有关。AV越大，表明脂质氧化程度越高[23]。在高温条件下，油脂受热易氧化导致其中酯键断裂而产生大量游离脂肪酸，从而造成AV过高[24]。炒制和杀菌后物料的AV显著升高（P＜0.05），这是由于温度升高加速酰基甘油热解，生成游离脂肪酸[25]，而且虾皮含有丰富的微量金属元素，受热条件下可加速催化油脂氧化、加快油脂氧化速度[26]。POV主要反映油脂中氢过氧化物的含量，通常与AV协同判定脂质品质[27]。氢过氧化物是脂质氧化产生的初级氧化产物。长时高温处理会使脂质氧化作用加速，POV升高。炒制导致物料的POV显著降低（P＜0.05），原因在于氢过氧化物的分解速率与其生成速率之间的关系会影响POV的变化[28]。杀菌使物料的POV无显著变化（P＞0.05），可能由于物料中含有的少量水分水化金属离子而降低其催化活性[29]，物料中的香辛料（胡椒、辣椒、生姜等）对脂质具有抗氧化作用[30]，此外杀菌的强度较低也会使得POV无显著变化[31]。《调味料产品生产许可证审查细则（2006版）》规定，含油性半固态调味料的发证检验、监督检验、出厂检验除芝麻酱外，都应对酸价和过氧化值项目做相关检测，因此本文后续选择AV和POV作为脂质抗氧化研究指标。

2.2 不同抗氧化剂对虾皮酱AV和POV的影响

在虾皮酱加工的降温工序中，分别加入不同浓度的EDTA-2Na，加速氧化5 d后分析样品的AV、POV，结果如图2所示。

图2 添加EDTA-2Na对虾皮酱AV和POV的影响Fig.2 Effects of EDTA-2Na addition on AV and POV of shrimp skin paste

由图2可知，添加EDTA-2Na能够有效降低虾皮酱的AV和POV。EDTA-2Na浓度≤0.0375 g/kg时，AV和POV均随浓度的增加而显著下降（P＜0.05）。EDTA-2Na浓度≥0.037 5 g/kg时，AV和POV随浓度的增加均无显著性下降（P＞0.05）。EDTA-2Na通过螯合物料中能促进氧化作用的微量金属元素来提升产品的抗氧化性[32]。综合考虑，后续抗氧化剂复配试验中，EDTA-2Na的适宜浓度为0.007 5 g/kg～0.037 5 g/kg。

在虾皮酱加工的降温工序中，分别加入不同浓度的迷迭香，加速氧化5 d后分析样品的AV、POV，结果如图3所示。

图3 添加迷迭香对虾皮酱AV和POV的影响Fig.3 Effects of rosemary addition on AV and POV of shrimp skin paste

由图3可知，添加迷迭香能够有效降低虾皮酱的AV和POV。迷迭香浓度≤0.225 g/kg时，AV随浓度的增加，在 0.030、0.090、0.225 g/kg浓度呈显著下降（P＜0.05）。迷迭香浓度≤0.300 g/kg时，POV随浓度的增加，在0.030、0.090、0.300 g/kg浓度呈显著下降（P＜0.05）。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定同一功能的食品添加剂在混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不应超过1。此外，在选择食品添加剂浓度时，还应考虑其经济性及其对指标值绝对值变化的影响。综合考虑，后续抗氧化剂复配试验中，迷迭香的适宜浓度为0.030 g/kg～0.150 g/kg。

在虾皮酱加工的降温工序中，分别加入不同浓度的VE，加速氧化5 d后分析样品的AV、POV，结果如图4所示。

图4 添加VE对虾皮酱AV和POV的影响Fig.4 Effects of VEaddition on AV and POV of shrimp skin paste

由图4可知，添加VE均能够有效降低虾皮酱的AV和POV。VE浓度≤0.4 g/kg时，AV随浓度的增加，在 0.1、0.2、0.4 g/kg 浓度呈显著下降（P＜0.05）。VE浓度≤0.3 g/kg时，POV随浓度的增加均显著下降（P＜0.05）。继续增加VE浓度，AV和POV均无显著变化（P＞0.05）。迷迭香的主要成分是多酚类化合物，张佳欣[33]发现多酚与VE按照一定比例混合时，DPPH·的清除能力随着混合物浓度的升高而增强，因此值得进一步研究迷迭香和VE复配物对虾皮酱脂质的抗氧化效果。综合考虑，后续抗氧化剂复配试验中，VE的适宜浓度为0.2 g/kg～0.4 g/kg。

2.3 抗氧化剂复配研究

根据设计方案，将3种抗氧化剂以不同浓度进行配比后，分别放入降温工序后的虾皮酱中，进行加速氧化试验，测定每组虾皮酱的AV和POV，结果如表3所示。

表3 试验设计方案和及结果Table 3 Experimental scheme and results

通过Design-Expert 11软件对AV和POV进行回归拟合，分别建立AV和POV的Special Quadratic回归方程。AV=0.240 35+0.534 167A-0.296 667B-0.634C-3.611 11AB+0.708 333AC+2.833 33BC-6.104 7A2-11B2+0.652 5C2；
POV=0.018 531-0.020 423A+0.098 557B+0.076 012C-0.027 643AB+0.047 369AC-0.500 443BC-0.238 710A2-0.510 829B2-0.138 717C2。

对AV和POV的回归方程模型进行方差分析，结果见表4和表5。

表4 AV的二次回归方程模型方差分析Table 4 Analysis of variance for quadratic regression equation of AV

由表4可知，回归方程模型的P＜0.01，表明该模型极显著；
模型失拟项的P=0.579 1＞0.05，说明模型失拟不显著。因此，该方程模型可以预测响应值。各模型项P值越小，试验设计水平下对响应值影响程度越大，因此对响应值AV影响大小为A＞C＞B。A、C项的P＜0.01，说明迷迭香浓度和VE浓度对响应值有极显著的影响。AB、AC和BC项的P＞0.05，说明迷迭香浓度、EDTA-2Na浓度和VE浓度彼此间交互作用不显著。相关系数R2=0.976 5说明回归方程拟合程度较好。校正系数R2Adj=0.946 3，预测系数R2Pre=0.841 6，变异系数C.V.%=4.72，表明此模型置信度高；
模型信噪比=19.702 6＞4，说明此模型具有足够强的信号强度，模型有效。

由表5可知，该回归方程模型的P＜0.01，表明该方程模型极显著；
模型失拟项的P=0.420 8＞0.05，说明模型失拟不显著。因此，该方程模型可以预测响应值。各模型项对响应值POV影响大小依次为A＞C＞B。一次项 A、B、C 的 P＜0.01，说明迷迭香浓度、EDTA-2Na浓度和VE浓度对响应值有极显著的影响。由交互项AB、AC和BC的P值可知，迷迭香浓度和EDTA-2Na浓度、迷迭香浓度和VE浓度的交互作用均不够显著，而EDTA-2Na浓度和VE浓度的交互作用显著。

2.4 复配抗氧化剂优选及验证

复配抗氧化剂优选及验证结果如表6所示。

表6 复配抗氧化剂优选及验证Table 6 Optimization and validation of compound antioxidant

由表6可知，3组复配抗氧化剂配方的响应值实际测量值与回归方程模型的预测值基本吻合，偏差较小。与空白组相比，添加了复配抗氧化剂的虾皮酱的AV和POV大幅下降，说明复配抗氧化剂能显著提高虾皮酱脂质的氧化稳定性。基于产品工业化生产的成本节约，选择配方3（0.150 g/kg迷迭香+0.037 g/kg EDTA-2Na+0.200 g/kgVE）作为复配抗氧化剂更为适宜。

虾皮酱总脂含量高达43.89 g/100 g，因此为提高产品脂质氧化稳定性和延长产品货架期，研究添加抗氧化剂对产品脂质氧化的影响具有现实意义。配料的稀释作用可显著降低虾皮酱制备过程中物料的总脂、甘油三酯、胆固醇和酸价（P＜0.05）。炒制导致物料的甘油三酯含量和过氧化值显著降低（P＜0.05），胆固醇含量、丙二醛含量和酸价显著升高（P＜0.05）。杀菌导致物料的酸价显著升高（P＜0.05），而对过氧化值的影响不显著（P＞0.05）。添加抗氧化剂迷迭香、EDTA-2Na、VE可显著增强虾皮酱的抗氧化性。各抗氧化剂对响应值影响程度的大小为迷迭香浓度＞VE浓度＞EDTA-2Na浓度。以物料质量为基准，最优复配抗氧化剂的配方为0.150 g/kg迷迭香+0.037 g/kg EDTA-2Na+0.200 g/kg VE。研究结果为虾皮酱生产过程中抗脂质氧化提供技术指导及理论支持。