麦粒灸合补肺祛瘀方对肺纤维化大鼠肺功能和核因子κB信号通路的影响

杨善军 王 玥 邢露茗 张晓莹 封 笑 肖 洋 付 晋 王 浩 李希尧

(1 黑龙江中医药大学附属第二医院肺病科，哈尔滨，150001；

2 北京中医药大学，北京，100029)

肺纤维化(Pulmonary Fibrosis，PF)是由多种因素引起的慢性肺部疾病，以炎症、成纤维细胞聚集和细胞外基质沉积为特征，最终导致肺结构破坏，阻碍血气交换[1]。目前常用免疫抑制剂(例如泼尼松龙)进行治疗，但由于疗效低和不良反应严重而受到限制，迫切需要具有改善的治疗功效和更少的不良反应的新治疗方法[2]。中医学认为，PF病变的实质是“肺络瘀滞”，属于“肺痹”“肺痿”等范畴。中医有大量使用中药方剂和麦粒灸治疗肺痿的文献记载。化瘀理肺方可以明显减轻大鼠肺泡炎和肺纤维化程度[3]。同时，麦粒灸肺俞治疗PF的疗效得到肯定[4]。但是中药和针灸治疗PF的作用机制尚不完全清楚。随着免疫机制研究的不断深入，炎症细胞和各种细胞因子在肺纤维化发病中的作用也受到人们越来越多的关注[5]。在参与纤维化进程的多种信号通路中，核因子κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)信号通路起关键作用[6]。核因子κB是上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的重要介质，可促进多种炎症介质的转录，如肿瘤坏死因子-α(Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α)、白细胞介素(Interleukin，IL)和转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)等，这些因子与PF的进展密切相关，尤其是TGF-β，在评价PF的药物疗效时，必须对这些因素进行检测[7]。因此，本研究用博来霉素制备大鼠PF模型，检测麦粒灸联合补肺祛瘀方对PF大鼠肺功能的改善作用，并探讨核因子κB信号通路的调控作用，为麦粒灸合补肺祛瘀方治疗PF提供理论依据。

1.1 材料

1.1.1 动物 体质量(200±20)g的SD大鼠购黑龙江中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(黑)2018-003，在温度(23±2)℃，湿度60%～70%，的环境中实用性喂养1周后进行实验。实验方案经黑龙江中医药大学动物实验伦理委员会批准(伦理审批号：[2020]黑中医伦理审字第012号)。

1.1.2 药物 补肺祛瘀方：由丹参20 g、黄芪20 g、虎杖20 g、川芎20 g、麦冬20 g共5味中药组成，加6倍量水煎煮提取2次，1 h/次，合并水煎液浓缩至77 mL，药物浓度为1.3 g/mL，冰箱贮存备用；
艾绒(蓟春千年艾科技有限公司生产，批号：54823)醋酸泼尼松片(江苏鹏鹤药业有限公司生产，批号:1404273)；
博来霉素(Invitrogen公司，美国，批号：R250-01)。

1.1.3 试剂与仪器 Masson染液和苏木精染色液(上海歌凡生物科技有限公司，批号：G200315)；
IL-1β、IL-6和TNF-α酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunoadsorption Assay，ELISA)试剂盒(上海歌凡生物科技有限公司，货号：G20021-3、G20014-2、G20062-4)；
Trizol试剂[生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：SG569]；
ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒和THUNDERBIRD qPCR Mix荧光定量PCR试剂盒(ToYoBo有限公司，日本，货号：FSQ-101、QPS-201)；
核因子κB上游引物为5′-GCTACACAGAGGCCATTGAA-3′,下游引物为5′-TCCCGGAGTTCATCTATGTG-3′；
TGF-β上游引物为5′-TGTACGGCAGTGGCTGAACCAA-3′,下游引物为5′-CGCTGAATCGAAAGCCCTGTATT-3′；
Smad2(Small Mother Against Decapentaplegic 2)信号转导分子2上游引物为5′-CCCTTCAATGGTTGGTACATGG-3′,下游引物5′-ACATTGATCTCCGTGACAGCC-3′；
GAPDH引物序列：上游引物为5′-TGCGACTTCAACAGCAACTC-3′，下游引物为：5′-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3′；
组织脱水机和全自动轮转切片机(德国徕卡生物科技有限公司，德国，型号：ASP300S、Leica RM2255)；
显微镜(奥林巴斯中国有限公司，型号：BX41)；
无创动物肺功能仪(北京吉安得尔科技有限公司，型号：BUXCO)；
蛋白核酸检测仪(NanoDrop公司，美国，型号：NanoDrop2000c)；
全自动医用PCR分析系统(北京乐普医疗科技有限责任公司，型号：Lepgen-96)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 选取60只成年SD大鼠(雌雄各半)按随机数字表法均分为空白对照组、模型组、泼尼松龙组、麦粒灸组、方药组、灸药组，每组10只。麻醉大鼠，轻拉鼠舌压迫舌腹，窥见声口，趁大鼠呼吸瞬间，迅速将与装有博来霉素溶液注射器相连的顶端磨钝的9号腰穿针插入达气管分叉处，随后慢慢推入博来霉素(5 mg/kg)溶液。给药结束时，辅助大鼠作直立、旋转等动作，以便药液在肺内分布充分、均匀，然后让大鼠自由饮水、进食。

1.2.2 给药方法 造模第7天后开始治疗，泼尼松龙组灌胃给予泼尼松龙(5 mg/kg)，麦粒灸组选取肺的背腧穴“肺俞”、治肺虚效穴“膏肓”，灸的方式选取麦粒灸，定位方式参考《实验针灸学》和《中国兽医针灸学》[9]；
方药组釆用灌胃给予补肺祛瘀方(生药量5 g/kg)[10]；
灸药组同时进行麦粒灸和灌胃补肺祛瘀方；
空白组和模型组按等容量生理盐水灌胃，1次/d，共治疗30 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 大鼠肺功能检测 末次治疗2 h后，对大鼠进行麻醉，将大鼠置于体描箱中，行气管插管，链接RES3020动物呼吸机，待数据曲线稳定后用BUXCO无创动物肺功能仪系统采集数据，包括用力肺活量(Forced Vital Capacity，FVC)、最大通气量(Maximal Voluntary Ventilation，MVV)和肺动态顺应性(Dyanamic Compliance，Cdyn)。

1.2.3.2 大鼠肺组织病理学检测 大鼠做完肺功能检测后，处死大鼠，分离肺组织，每组用5只大鼠右肺上叶进行甲醛溶液固定，经脱水、包埋、切片后，进行Masson和苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色，观察肺组织病理学变化。

1.2.3.3 支气管肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平检测 每组用5只大鼠进行右侧主支气管近端和气管远端结扎，在气管结扎下端用0.3 mL预冷生理盐水进行右肺灌洗，重复3次，回收支气管肺泡灌洗液，6 000 r/min，离心半径11.2 cm，离心时间30 min，取上清液；
用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，操作步骤说明书进行。

1.2.3.4 肺组织中核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA水平检测 将左肺组织进行研碎，用TRIzol提取总RNA，用NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪对RNA的浓度和纯度进行测定，根据ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒说明合成cDNA，再根据THUNDERBIRD qPCR Mix荧光定量PCR试剂盒说明，制备20 μL反应体系进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃ 30 s预变性、95 ℃ 5 s变性、60 ℃ 44 s、40个循环，61 ℃时采集荧光，以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct法计算核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA的表达量。

2.1 麦粒灸合补肺祛瘀方对PF大鼠肺组织病理学形态的影响 Masson染色显示，对照组大鼠肺组织未见明显纤维化；
模型组肺组织中胶原沉积明显，特别是支气管周围；
经泼尼松龙、麦粒灸和方药治疗后，肺组织胶原沉积明显减少，其中泼尼松龙组改善最显著；
HE染色显示，对照组大鼠肺组织未见明显异常；
模型组大鼠肺部表现出纤维增生，炎症细胞浸润，肺泡壁增厚，肺泡破坏和紊乱以及肺泡间隙部分塌陷；
经泼尼松龙、麦粒灸和方药治疗后，肺组织在炎症和纤维化明显改善，其中泼尼松龙组改善最显著。见图1～2。

图1 麦粒灸合补肺祛瘀方对PF大鼠肺组织病理学形态的影响(Masson染色，×200)

图2 麦粒灸合补肺祛瘀方对PF大鼠肺组织病理学形态的影响(HE染色，×200)

2.2 麦粒灸合补肺祛瘀方对PF大鼠肺功能的影响 与空白对照组比较，其余各组大鼠FVC、MVV和Cdyn降低(P<0.05)；
与模型组比较，各治疗大鼠FVC、MVV和Cdyn升高，其中灸药组疗效好于麦粒灸组和方药组，而泼尼松龙组疗效最好(P<0.05)。见表1。

表1 麦粒灸合补肺祛瘀方对PF大鼠肺功能的影响

2.3 麦粒灸合补肺祛瘀方对PF大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响 与空白对照组比较，其余各组大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6升高(P<0.05)；
与模型组比较，各治疗大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6降低，其中灸药组疗效好于麦粒灸组和方药组，而泼尼松龙组疗效最好(P<0.05)。见表2。

表2 各组PF大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较

2.4 麦粒灸合补肺祛瘀方对PF大鼠肺组织中核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA水平的影响 与空白对照组比较，其余各组大鼠肺组织中核因子κB、TGF-β和Smad2升高(P<0.05)；
与模型组比较，各治疗大鼠肺组织中核因子κB、TGF-β和Smad2降低，其中灸药组疗效好于麦粒灸组和方药组，而泼尼松龙组疗效最好(P<0.05)。见表3。

表3 各组PF大鼠肺组织中核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA水平比较

PF是一种慢性、致命的间质性肺疾病，以肺泡炎症和肺纤维化为主要特征，尽管有很多药物(如泼尼松龙)被用于治疗PF，但其疗效有限，中位生存时间在2～4年。因此，寻找新的PF治疗方法具有重要意义。多年来，我们在临床上以麦粒灸和方剂配合方法治疗肺纤维化，疗效肯定。研究表明，麦粒灸肺俞、膏肓俞可以改善肺功能，增加肺通气量[11]。同时，补肺祛瘀方中黄芪味甘微温，入肺脾经，具有补中益气的功效；
麦冬养阴润肺，治肺燥咳嗽，助君药润肺之功；
虎杖具有清热解毒、止咳化痰的功效；
丹参和川芎具有祛瘀生新之力。全方具有补气养阴、化瘀祛痰之功[12]。本研究结果显示，麦粒灸联合补肺祛瘀方改善肺功能的效果强于单独麦粒灸或补肺祛瘀方治疗，同时减轻了博来霉素诱导的肺部炎症和纤维化。此外，在博来霉素诱导的炎症反应中，麦粒灸联合补肺祛瘀方治疗抑制了核因子κB信号通路的激活。

在肺部博来霉素暴露的早期阶段，肺泡上皮细胞受到DNA损伤并释放出活性氧，这将引起强烈的炎症反应，其中炎症细胞会渗透到肺组织并开始纤维化。博来霉素诱导纤维化的炎症细胞主要包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。其中，巨噬细胞会分泌趋化因子，招募炎症细胞和促纤维化细胞因子，如TNF-ɑ和IL-6，以创造纤维化微环境[13]。同时，同时还释放TGF-β诱导细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)的积累，诱导成纤维细胞产生高水平ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-Smooth Muscle Actin，ɑ-SMA)和胶原蛋白[14]。这些细胞因子的启动子区域包含与核因子κB的结合位点，因此，转录因子可以调节核因子κB基因表达[15]。本研究结果显示，麦粒灸联合补肺祛瘀方降低了大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

核因子κB信号通路依赖的炎症反应在许多炎症性和纤维化疾病中起关键作用，并在博莱霉素介导的气道重塑中发挥重要作用。在巨噬细胞中，核因子κB信号参与病原相关的分子模式[16]。核因子κB信号通路的激活核因子κB抑制因子(Inhibitor of NF-κB,I-κB)激酶，I-κB降解导致核因子κB p50/核因子κB p65二聚体的磷酸化和易位，最终导致各种基因的转录。博莱霉素刺激导致IkB磷酸化，导致核因子κB转位到细胞核[17]。研究表明，炎症介质和促纤维细胞因子在PF进程中发挥关键作用。这些细胞因子的调节部分是由核因子κB介导的[18]。因此，核因子κB仍然是抗纤维化药物的一个有吸引力的靶点。尽管炎症细胞会产生趋化因子和细胞因子促使肺组织损伤和重塑，但TGF-β是一种被巨噬细胞激活的关键纤维化细胞因子，在成纤维细胞重塑中起着关键作用。动物模型和PF患者的肺组织中TGF-β均升高[19]。TGF-β可调控成纤维细胞向肺成纤维细胞迁移，增殖和分化为成纤维细胞，其特征在于α-SMA的表达和ECM的沉积。在炎症条件下，内皮细胞上的Smad2表达主要是由活性氧诱导的。同时，通过阻断白细胞与Smad2的结合或抑制Smad2信号转导来抑制炎症[20]。高浓度的活性氧激活了核因子κB并促使成纤维细胞中表达Smad2[21-22]。本研究结果显示，麦粒灸联合补肺祛瘀方抑制核因子κB、TGF-β和Smad2的活性。

综上所述，麦粒灸合补肺祛瘀方可能通过抑制核因子κB信号通路，降低PF大鼠肺组织炎症水平，并改善肺部微结构，从而改善PF大鼠肺功能，为麦粒灸合补肺祛瘀方治疗PF提供理论依据。