基于核酸适配体的比率荧光探针定量检测血浆外泌体

柴亚茹，高孜博，丁丽华，吴拥军

郑州大学公共卫生学院卫生化学教研室 郑州 450001

外泌体是由活细胞释放的具有脂质双层膜的囊泡，直径30～150 nm，能够在体液中进行细胞间通信[1-3]。外泌体作为肿瘤生物标志物具有许多优势，如丰度高(每毫升血液中多达1010个囊泡)、稳定性强、可反映原始细胞实时状态、丰富内含物和可实现纵向取样[4-5]。当前外泌体的常用定量检测技术主要有纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)[6]、可调电阻脉冲传感技术[7]、电化学[8]、荧光[9]、表面增强拉曼散射[10]、表面等离子体共振[11]等技术。然而上述方法存在操作步骤繁琐、特异性低、无法排除脂蛋白颗粒或蛋白质聚集物的干扰、重现性较差等局限性，严重限制了在快速、实时检测中的推广应用[8,12-13]。当前外泌体计数的挑战主要是如何选择性和精确地分析纳米级外泌体，而不需要繁琐的过程，因此，建立一种方便、快速、灵敏、准确、重现性好的检测方法具有重要意义。核酸适配体具有高特异性、高亲和力、稳定性好等优势，引入信号标记抗体或适配体来量化外泌体可以提高特异性[14-15]，且荧光定量法具有操作方便快捷、花费低、灵敏度高等优点[16]。但常规的荧光分析法容易受外界因素的影响，特别是样品背景影响较大。为此，本研究利用荧光探针Cy5及SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)核酸染料建立了一种比率荧光检测方法，通过制备适配体-链霉亲和素磁珠作为捕获分离单元，并将该方法用于血浆样品外泌体水平的检测，现报道如下。

1.1 主要试剂和仪器人肺腺癌细胞株A549(中国科学院细胞库)，链霉亲和素磁珠(streptavidin magnetic nanoparticles，MNPs；
无锡百迈格生物科技有限公司)，DMEM高糖培养基、乙二胺四乙酸(EDTA)、2.5 g/L胰蛋白酶消化液(含EDTA)、袋装PBS粉、Tween-20、SGⅠ、TE缓冲液、BCA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，共沉淀试剂Total Exosome Isolation(美国赛默飞世尔科技有限公司)，HT-7700透射电子显微镜(日本Hitachi公司)，NanoFCM N30E单颗粒纳米生物粒径分析仪(四川极奇科技有限公司)，Nano Drop 2000超微量紫外分光光度计(Thermo Scientific公司)，Nanosight NS300纳米颗粒跟踪分析仪(英国马尔文帕纳科有限公司)，FS5荧光光谱仪(英国爱丁堡仪器公司)。CD63核酸适配体(Cy5-Apt)核酸序列：Cy5-TAGCATTAGT GTCTTTTTTCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAAT GCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Biotin(核酸序列均购自上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 外泌体的提取与表征A549细胞在体积分数5%的CO2、37 ℃培养条件下达到约60%覆盖率时，冲洗细胞后加入无胎牛血清的DMEM培养基继续培养，48 h后收集上清液，4 ℃保存。将细胞上清液行逐步差速离心(300×g，10 min；
2 000×g，10 min；
10 000×g，30 min)，均收集上清液。将上清液通过0.22 μm的过滤器后加入超滤管滤膜夹层中，4 000×g离心15 min，收集上层浓缩液。加入共沉淀试剂，吹打混匀，4 ℃放置12 h。10 000×g离心60 min，加入PBS重悬，-80 ℃保存备用。通过透射电子显微镜观察外泌体形态和大小，利用NTA检测粒径分布和浓度，Western blot法测定标志蛋白CD63、TSG101和HSP70蛋白表达。

1.3 比率荧光免疫磁珠的构建首先取20 μL 2 g/L的MNPs于200 μL低吸附离心管中，磁分离，弃上清液。再用PBST缓冲液洗涤MNPs 3次，磁分离，弃上清液后加入50 μL 400 nmol/L Cy5荧光探针标记的生物素化CD63核酸适配体工作液，混匀，振荡30 min，磁分离，弃上清液。取50 μL杂交缓冲液清洗磁珠2次，磁分离，得到CD63核酸适配体修饰的磁颗粒(MNPs-Apt)。向清洗后的MNPs-Apt中加入50 μL 20×的SGⅠ工作液，吹打混匀，振荡15 min，磁分离。PBST缓冲液混悬清洗磁珠，磁分离，弃上清液，得到比率荧光免疫磁珠(MNPs-Apt-SGⅠ)。

1.4 可行性分析通过激光共聚焦显微镜观察Cy5-Apt是否可以与外泌体特异性结合。测定Cy5荧光探针在不同浓度外泌体中的荧光强度，探究Cy5荧光基团作为固定基团，其荧光强度是否在不同浓度的外泌体环境中具有稳定性。检测SGⅠ荧光染料在不同浓度外泌体中的荧光变化(SGⅠ荧光基团是嵌入在适配体的双链结构中的，而适配体可捕获外泌体，因此其荧光强度应随外泌体浓度的增大而减小)。最后考察MNPs对SGⅠ荧光探针的吸附性(随着SGⅠ荧光染料浓度的增大，若体系的荧光强度基本不变，则可以判定MNPs对SGⅠ荧光染料的吸附性可以忽略不计)。

1.5 外泌体比率荧光探针定量检测方法在MNPs-Apt-SGⅠ中加入50 μL外泌体稀释液，振荡，室温孵育60 min，磁分离后去上清液，PBST缓冲液清洗2次，去上清液后加入60 μL的杂交缓冲液，重悬磁珠沉淀。使用FS5荧光光谱仪分别扫描两种基团荧光强度(SGⅠ染料激发波长为496 nm，Cy5荧光基团激发波长为648 nm)。按照公式(1)计算各血浆样本的荧光比值信号[Δ(FC/FS)]，每个样品均检测3个复孔。

(1)

其中，FC表示被检测点的Cy5荧光强度，FS表示被检测点的SGⅠ荧光强度，FC0表示空白对照的Cy5荧光强度，FS0表示空白对照的SGⅠ荧光强度。

1.7 特异性及实际样品检测选择实际样品中常与外泌体共存的白蛋白、脂质体、微囊泡细胞碎片作为检测目标。将其用PBS按照蛋白浓度定量(均配制成0.013 g/L的溶液，即对应外泌体颗粒浓度为4.0×106个/μL)，用建立的方法检测荧光比值(FC/FS)并比较，评价所建立的方法的特异性。选择实际血浆为样品[收集2018年12月至2019年12月某医院呼吸内科住院的肺癌患者(16例)和健康体检中心健康对照者(10人)全血样本，4 000 r/min 4 ℃离心后收集血浆，置于冻存管中于-80 ℃冰箱中保存备用]进行检测。该研究获郑州大学生命科学伦理审查委员会的批准，研究对象均已签署知情同意书。肺癌患者符合以下入选标准：①以《中华医学会肺癌临床诊疗指南(2019版)》为标准，经病理学或细胞学被证实为原发性肺癌。②入组前未接受放化疗、药物治疗或手术治疗。③无主要脏器功能衰竭。④未合并其他恶性肿瘤。⑤未处于妊娠或哺乳期。所有健康对照者符合以下入选标准：①无肝炎、梅毒、艾滋病等传染病病史和恶性肿瘤史。②无糖尿病、高血压、心脑血管疾病及免疫系统疾病史。③与试验组年龄和性别相匹配。④无主要脏器功能衰竭。⑤未合并其他肺部或呼吸系统疾病。⑥未处于妊娠或哺乳期。

1.8 统计学处理采用SPSS 21.0处理数据，血浆外泌体浓度不符合正态分布，故采用中位数和四分位数进行描述，使用Mann-WhitneyU非参数检验进行两组间差异分析，检验水准α=0.05。

2.1 比率荧光探针定量检测外泌体的原理外泌体比率荧光探针定量方法的检测原理如图1所示。选择发夹型CD63核酸适配体作为外泌体捕获适配体，同时在5’端修饰Cy5荧光探针，在3’端修饰生物素。利用生物素和链霉亲和素之间的特异性结合将Cy5-Apt固定到MNPs上，构建MNPs-Apt。将双链特异性荧光探针SGⅠ特异性嵌入发夹型CD63核酸适配体的茎部，从而构建MNPs-Apt-SGⅠ。当外泌体存在时，发夹型CD63核酸适配体特异性识别并结合外泌体表面蛋白CD63，导致发夹型结构改变，SGⅠ探针脱离MNPs-Apt-SGⅠ，引起磁珠上SGⅠ荧光强度大幅减弱，而Cy5荧光恒定，将两种荧光探针的荧光强度比值与外泌体浓度之间建立标准曲线，可以实现对外泌体的定量检测。

2.2 外泌体的表征及MNPs-Apt-SGⅠ的构建结果见图2。在透射电子显微镜下观察到外泌体均呈杯盘状小囊泡，大部分直径为30～150 nm；
超滤联合共沉淀法提取的外泌体浓度约为2.41×1010个/mL；
外泌体膜上的CD63和TSG101蛋白在相对分子质量约30 000和48 000处、HSP70蛋白在相对分子质量约70 000处有表达，可确认提取到的小囊泡为外泌体。在496 nm波长的激发光下，MNPs-Apt-SGⅠ在601 nm处有明显的荧光峰值出现，说明SGⅠ荧光探针成功修饰在免疫磁珠表面，MNPs-Apt-SGⅠ构建成功。

图1 外泌体比率荧光探针定量检测方法的检测原理

A：超滤共沉淀法提取的外泌体透射电子显微镜图(红色箭头标注为外泌体)；
B：超滤共沉淀法提取的外泌体NTA分析；
C：外泌体CD63、TSG101和HSP70的表达；
D：比率荧光磁珠的SGⅠ荧光光谱

2.3 MNPs-Apt-SGⅠ检测外泌体的可行性分析如图3A所示，在激光共聚焦显微镜下，溶液中仅有发夹探针Cy5-Apt时，从暗场中观察不到红色荧光，而当Cy5-Apt与外泌体孵育后，从图中可以观察到荧光信号很强的点，提示Cy5-Apt可以与外泌体特异性结合。如图3B所示，Cy5荧光探针的荧光强度在不同浓度的外泌体环境中变化不大；
如图3C所示，SGⅠ荧光基团的荧光强度随外泌体浓度的增大而减小；
如图3D所示，随着SGⅠ荧光染料浓度的增大，体系的荧光强度基本不变，因此可以判定MNPs对SGⅠ荧光染料无明显吸附。

A：激光共聚焦显微镜鉴定Cy5-Apt对外泌体的结合；
B：Cy5荧光探针在不同浓度外泌体中的荧光稳定性；
C：SGⅠ荧光染料在不同浓度外泌体中荧光变化；
D：MNPs对SGⅠ荧光染料无明显吸附性

2.4 检测条件的优化及方法学评价检测条件优化见图4A～E。图4F显示，外泌体浓度在8.0×104～ 1.0×107个/μL范围内，Δ(FC/FS)与外泌体浓度呈良好的线性关系，标准曲线线性拟合方程为y=3.49×lg(x/104)-0.63;y:Δ(FC/FS),x:外泌体浓度，决定系数(R2)为0.996。

由表1可知，无外泌体胎牛血清配制的低、中、高3个浓度(分别为1.0×105、1.0×106、8.0×106个/μL)的外泌体加标溶液中平行测定3次，计算得到RSD为0.6%～26.4%，表明在中、高浓度时精密度较好；
3个浓度的加标回收率分别为94.5%、95.4%和97.2%，表明准确度较好。

A：MNPs用量的优化；
B：Cy5-Apt浓度的优化；
C：SGⅠ探针浓度的优化；
D：MNPs-Apt-SGⅠ与外泌体反应时间的优化；
E：MNPs-Apt-SGⅠ与外泌体反应温度的优化；
F：外泌体定量检测的标准曲线

表1 比率荧光探针定量检测方法的精密度RSD和加标回收率(n=3)

2.5 特异性及血浆样品检测见图5。由图5A可知，当检测目标浓度一样时，外泌体的荧光信号比值明显最大。结果表明，该方法检测外泌体的特异性较好。

为验证该方法的实际应用能力，将其应用于血浆外泌体的检测，结果显示肺癌患者组的血浆外泌体浓度总体分布范围高于健康对照组(P<0.01)(图5B)。因此，该方法可用于血浆中外泌体的定量，具有较高的实际应用价值。

A：比率荧光定量检测方法的特异性(n=3)；
B：比率荧光定量检测方法对两组血浆样本中外泌体的检测结果；
*：两组相比，P<0.01

迄今为止，多种分析方法，包括NTA、Western blot法和酶联免疫吸附试验(ELISA)，已广泛用于外泌体的检测。NTA能够实现简单、快速，不破坏外泌体原始状态定量，但定量准确性容易受到脂蛋白或蛋白质聚集体的干扰，无法选择性地检测特定的外泌体[12,17]。Western blot法和ELISA法可以通过识别癌症外泌体和正常外泌体的特异性蛋白质来进行区分，但由于低灵敏度或定量分析受限制[18-19]，限制了它们在临床诊断中的应用。该研究构建的比率荧光探针定量检测方法能够极大地削减探针浓度、温度、极性、环境的pH值、稳定性等诸多因素的干扰，可通过两个波长处荧光强度的比值与目标物浓度之间的关系来定量目标物含量。该方法不需要繁琐的外泌体分离过程，且检测所需的样品消耗较低，简化了操作步骤，具有良好的灵敏度。特异性的方法学评价结果显示该方法对环境中可能与外泌体共存的白蛋白、脂质体、微囊泡反应较差，对外泌体特异性较强，可有效避免其他物质的干扰。此外，该研究构建的比率荧光探针定量检测方法用于分析血浆中外泌体浓度时，与以往研究结果中肿瘤细胞外泌体分泌水平高于正常细胞的研究结果[20-21]相一致，说明该方法可用于血浆中外泌体的定量，具有一定的临床应用价值。