黄芪生脉对气虚和阴虚症的治疗作用研究

占扎君,郑 琼,彭 媛,裘飞君,陈 艳

(1.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014;2.浙江新光药业股份有限公司,浙江 绍兴 312000)

生脉饮由张元素的《医学启源》中记载的生脉散演变而来[1]。传统的生脉饮由人参、麦冬和五味子组成[2-4],而由党参、麦冬和五味子组成的党参方生脉饮是由传统的生脉饮演变而来,两者均具有益气滋阴、养心复脉的功效[5-7]。相较于人参,党参的性较平,较缓和,适用于轻症和慢性疾病,而人参方生脉饮则多用于重症或者急症[8-9],两者的临床应用历史已经十分悠久,备受医者青睐[10]。笔者研究使用的是党参方生脉饮,侧重于生津养血,补中益气[11]。黄芪是豆科植物的中药材,被誉为是补气血的良药[12-13],临床上常用于脾肺气虚等症状。在党参方生脉饮中加入黄芪,即为黄芪生脉饮复方,该复方可增强补虚和补气的作用,主要用于气阴两亏,心悸气短,自汗和病毒性心肌炎[14-17]等症状。目前,大量的研究报道都集中在人参方生脉饮,对于党参方生脉饮的报道较少,且多集中于成分的测定以及质量控制[18]。

以党参方生脉饮为研究对象,在生脉饮基础上加入黄芪制成黄芪生脉饮及黄芪生脉颗粒,通过构建小鼠气虚症、阴虚症模型,研究黄芪生脉饮及黄芪生脉颗粒对于气虚和阴虚症状的作用,对其作用机制进行探讨,为其进一步开发利用提供数据参考。

1.1 药品与试剂

黄芪生脉饮及黄芪生脉颗粒,批号:20170705,20180704,购自新光药业股份有限公司;六味地黄丸(4 g/kg),批号:190643,购自上海普康药业有限公司;肝糖原ELISA试剂盒,批号:20191107、肌糖原ELISA试剂盒,批号:20191108、cAMP ELISA试剂盒,批号:20191112、cGMP ELISA试剂盒,批号:20191113、印度墨汁,批号:20191115,均购自上海源叶生物科技有限公司;PBS缓冲液,购自北京索莱宝科技有限公司;甲状腺素片(80 mg/kg),批号:20190603、碳酸钠,购自上海长城药业有限公司。

1.2 仪 器

721分光光度计,购自上海光谱仪器有限公司;BS224S电子分析天平,购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;5810R高速冷冻离心机,购自贝克曼库尔特公司。

1.3 动 物

雌性ICR小鼠168只,20～24 g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,寄养于浙江工业大学实验动物中心动物房,动物质量许可证号:SCXK(浙)2019-0002。

2.1 分组、造模与给药

气虚小鼠模型:中医理论中素有疲劳耗气伤气的说法,过度疲劳则会耗气,长此以往则会有气虚的表现,采用小鼠负重游泳至力竭法建立气虚小鼠模型,该法操作方便且造模时间短,是适用于研究气虚病症的一种较好的造模方法[19]。小鼠随机分为正常组、模型对照组、模型给药组—黄芪生脉饮、颗粒高剂量组(373 mg/kg)、黄芪生脉饮、颗粒中剂量组(280 mg/kg)、阳性对照组(六味地黄丸4 g/kg),每组12只。实验过程中,连续给予基础进食量。除正常组小鼠,所有组小鼠游泳的水温均控制在25 ℃,盛于塑料桶中。小鼠游泳时,不可将尾部撑在池底休息。除正常组外,各组小鼠10%尾部负荷体质量游泳致力竭,1次/d;其他的实验期间内,各组小鼠均按照常规来进行,每次小鼠游泳至力竭时才结束其在水中的强迫运动。笔者实验参照MCARDLE推荐的力竭判断标准,即游泳至最后下沉,经10 s后仍没有返回水面为力竭[20-21]。

阴虚小组模型:以甲状腺素灌胃建立小鼠阴虚模型,其造模思路主要是模拟“甲状腺功能亢进”时出现的怕热,体温升高,基础代谢率提高等类阴虚的现象,以甲状腺激素造模,小鼠的死亡率低,操作方便且造模时间短,是深入研究阴虚病症的一种较好的造模方法[22]。将小鼠随机分为7组,每组12只,分别为正常组、模型对照组(甲状腺80 mg/kg)、模型给药组—黄芪生脉饮及黄芪生脉颗粒高剂量组(373 mg/kg)、黄芪生脉饮及黄芪生脉颗粒低剂量组(186.5 mg/kg)、阳性对照组(六味地黄丸4 g/kg)。在实验过程中,上午除正常对照组外均灌胃给药甲状腺素80 mg/kg,正常对照组给予等体积的生理盐水,下午各组分别灌胃各组药物,连续灌胃14 d。其余实验期间,各组小鼠均按常规进行,每次小鼠游泳至力竭时才结束其在水中的强迫运动。

2.2 气虚小鼠模型组

2.2.1 小鼠体质量测定

所有小鼠至实验第1,4,8,12,15天时,于药品灌胃后30 min称质量。

2.2.2 负重游泳耐力时间

所有小鼠实验于第1,4,8,12,15天称重后,尾部以体重10%负荷,在恒温水槽中进行力竭游泳实验,单独游泳致力竭并记录其时间,并分析最后一天各组小鼠游泳时间。

2.2.3 血浆中cAMP和cGMP的浓度测定

实验第15天,末次给药30 min后,随机选取每组中6只小鼠,并对其摘眼球取血,加入0.9 ml PBS缓冲液,置于冰上匀浆,ELISA试剂盒检测血浆中cAMP和cGMP的浓度,并求出其cAMP/cGMP的比值水平。

2.2.4 糖原的质量分数测定

实验第15天,末次给药30 min后,随机选取每组中6只小鼠,肝糖原:取小鼠0.1 g肝脏加入0.9 mL的PBS缓冲液置于冰上匀浆,3 000 r/min离心10 min,取上清采用酶联免疫法测定肝糖原的质量分数;肌糖原:取股四头肌0.1 g,加入0.9 mL的PBS缓冲液置于冰上匀浆,3 000 r/min离心10 min,取上清,采用酶联免疫法测定肌糖原的质量分数。

2.2.5 吞噬指数以及碳粒廓清指数的计算

实验第15天,末次给药30 min后,对各组剩余小鼠尾静脉注射20%印度墨汁0.1 mL/10 g,在注射2 min和10 min后,分别从眼眶后静脉丛取血20 μL,溶于2 mL 0.1%的Na2CO3溶液中摇匀,置于721型分光光度计,波长600 nm处比色,测定光密度OD,最后将小鼠脱臼处死,分别称取肝、脾质量。

碳粒廓清指数K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)

(1)

式中:K为碳粒廓清指数;OD1和OD2分别为注射2 min,10 min后的光密度,t1和t2分别为2 min,10 min。

吞噬指数α=k1/3×体质量/(肝质量+脾质量)

(2)

式中:α为吞噬指数;k为碳粒廓清指数。

2.3 阴虚小鼠模型组

2.3.1 小鼠体重测定

所有小鼠至实验第1,4,8,12,15天时,于药品灌胃后30 min称质量。

2.3.2 负重游泳耐力时间测定

所有小鼠最后一次给药1 h后进行负重力竭游泳,在小鼠尾根部负荷其体质量10%的铅条作为重物,放入水深35 cm,水温(20±5) ℃的水桶中,小鼠的尾巴不能接触桶底,每次2 只,力竭判断标准为小鼠沉入水底超过9 s不能回到水面,为力竭游泳时间,及时将小鼠捞起,吹干毛发。

2.3.3 肌肉中cAMP和cGMP的浓度测定

实验第15天,末次给药30 min后,随机选取每组中6只小鼠,称取0.1 g小鼠大腿处肌肉,加入0.9 mL的PBS缓冲液,置于冰上匀浆,在ELISA试剂盒检测肌肉内cAMP和cGMP的浓度,并求出其cAMP/cGMP的比值水平。

2.3.4 糖原的质量分数测定

实验第15天,末次给药30 min后,随机选取每组中6只小鼠,称取0.1 g小鼠大腿处肌肉,加入0.9 mL的PBS缓冲液,置于冰上匀浆,3 000 r/min离心10 min,取上清采用酶联免疫法测定肌糖原的质量分数。称取0.1 g小鼠肝脏,加入0.9 mL的PBS缓冲液,置于冰上匀浆,3 000 r/min离心10 min,取上清用ELISA试剂盒检测肝糖原的质量分数。

3.1 气虚小鼠模型组

3.1.1 体重测定

相较于与正常组，造模后的模型组小鼠的体重明显降低,具有显著性差异(p<0.01),各给药组与模型组相比小鼠的体重无显著性差异,由此可以发现给药黄芪生脉饮、颗粒不会对小鼠的体重造成影响,各组小鼠的体重变化情况如图1所示。图1中：##表示与正常组相比,p<0.01。

图1 黄芪生脉饮、颗粒对小鼠体重的影响Fig.1 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on body weight of mice

3.1.2 负重游泳耐力时间测定

气虚最直观的表现就是疲劳和无力,运动耐力是反映机体疲劳最直接、最客观的指标,而力竭游泳时间则是反映运动耐力的主要指标。各组小鼠的力竭游泳时间如图2所示。与模型组相比,*表示p<0.05；
**表示p<0.01；
***表示p<0.001。

1—正常组;2—模型组;3—阳性组;4—黄芪生脉饮中剂量组;5—黄芪生脉颗粒中剂量组;6—黄芪生脉饮高剂量组;7—黄芪生脉颗粒高课题组。图2 黄芪生脉饮、颗粒对小鼠运动能力的影响Fig.2 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on exercise ability of mice

由图2可知:相较于正常组，造模后的模型组小鼠虽然单独游泳致力竭的时间下降,但是差异无统计学意义(p>0.05),阳性组与模型组相比,虽然给药后游泳时间有所增加,但是差异仍无统计学意义(p>0.05)。而不论是黄芪生脉饮还是黄芪生脉颗粒,与模型组相比,中剂量给药以后,不仅游泳时间明显增加,而且差异有统计学意义(p<0.05),高剂量给药后,游泳时间延长,具有显著性差异(p<0.01)。结合力竭游泳时间是反应运动耐力的主要指标,可以发现中、高剂量的黄芪生脉饮和颗粒不仅具有缓解疲劳的作用,而且可能有剂量依赖性。

3.1.3 血浆中cAMP和cGMP的浓度测定

cAMP和cGMP两者呈拮抗性共同参与细胞反应的调节,在正常的情况下,cAMP和cGMP的水平呈相反的变化,且两者的浓度要保持动态平衡,从而使机体保持平衡,测定cAMP和cGMP的浓度以及两者的比值可以作为气虚的一个客观性指标。黄芪生脉饮、颗粒对气虚小鼠血浆中cAMP和cGMP浓度的影响如表3所示。

表3 黄芪生脉饮、颗粒对气虚小鼠血浆中cAMP和cGMP的影响Table 3 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on cAMP and cGMP in plasma of mice with qi deficiency

由表3可知:与正常组相比,造模后血浆中cAMP的浓度增加,cGMP的浓度减少,且具有显著性差异(p<0.01),符合气虚模型特点;与模型组相比,各给药组给药后,血浆中cAMP浓度均降低,其中高剂量给药组的效果更加明显(p<0.001),血浆中cGMP浓度均升高,高剂量给药组的效果仍然更加明显(p<0.01),说明中、高剂量的黄芪生脉饮、颗粒不仅可以改善小鼠的阴虚状态,而且可能呈剂量依赖性。

3.1.4 糖原的质量分数测定

肌肉活动时所需要的能量主要来自于糖原,强度较大的运动之后,肌糖原的质量分数会有所降低,体力的衰竭与肌糖原的衰竭几乎是同时发生的,所以一般可以用糖原的质量分数来间接说明疲劳程度,在肌糖原减少的同时,为了维持体内血糖的水平,肝糖原的储备量也会降低,因此可以将糖原的质量分数作为评价指标之一。各组小鼠的糖原质量分数变化情况如表4所示。

表4 黄芪生脉饮、颗粒对小鼠糖原质量分数的影响

由表4可知:与正常组相比,肝糖原与肌糖原的质量分数均无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05);与模型组相比,各给药组给药后,肝糖原质量分数均升高,且具有显著性差异(p<0.05),黄芪生脉饮、颗粒中剂量给药组、阳性给药组给药后,肌糖原质量分数均无统计学意义(p>0.05),黄芪生脉饮、颗粒高剂量给药后,肌糖原质量分数增加,具有统计学意义(p<0.05),说明中、高剂量的黄芪生脉饮、颗粒不仅可以增加肝糖原的储备,而且可以提高肌糖原的质量分数。

3.1.5 碳粒廓清指数和吞噬指数

单核巨噬细胞系统(网状内皮系统,Reticuloen-dothelialsystem,RES)是机体非特异性免疫系统的重要组成部分,因其能迅速清除多种致病物质,故是维持机体内环境稳定的一个最重要的系统。作为免疫细胞的一种,巨噬细胞具有多种免疫功能,参与免疫反应,在炎症、肿瘤以及感染等很多疾病中都发挥了很重要的作用。在一定范围内体内碳颗粒被清除速率与血碳浓度呈指数函数关系。黄芪生脉饮、颗粒对小鼠吞噬指数和碳粒廓清速度的影响如表5所示。

表5 黄芪生脉饮、颗粒对小鼠吞噬指数和碳粒 廓清速度的影响

由表5可知:与正常组相比,造模后模型组小鼠的吞噬指数和碳粒廓清指数明显减低,有显著性差异(p<0.01),符合气虚模型的特点;与模型组相比,黄芪生脉饮、颗粒中剂量,黄芪生脉饮、颗粒高剂量及阳性组给药后,小鼠吞噬指数升高,有统计学意义(p<0.05),说明低、高计量的黄芪生脉饮、颗粒均可以提高吞噬细胞的吞噬能力,可以调节小鼠的非特异性免疫功能。针对碳粒廓清指数,与模型组相比,各给药组小鼠给药后都显著升高,有统计学意义(p<0.05),进一步说明低、高剂量的黄芪生脉饮和颗粒均可以增强小鼠的非特异性免疫功能。

3.2 阴虚小鼠模型组

3.2.1 体质量测定

小鼠体质量的变化情况如图3所示。图3中:##表示与正常相比,p<0.01。由图3可知:实验刚开始时,与正常组相比,各组小鼠的体质量明显降低,有显著性差异,符合阴虚证的一般状态特征,并且各组小鼠体质量总体呈上升趋势,给药组与模型组之间无明显差异,说明甲状腺素对小鼠体质量不会造成影响,且高、低剂量给药黄芪生脉饮、颗粒均可以使小鼠的体质量恢复至正常水平。

图3 黄芪生脉饮、颗粒对小鼠体质量的影响Fig.3 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on weight of mice

3.2.2 力竭游泳时间测定

各组小鼠负重力竭游泳时间的测定结果如图4所示。图4中:与正常组相比,##p<0.01,与模型组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。由图4可知:与正常组比较,模型组小鼠的负重力竭游泳时间显著缩短,具有显著性差异(p<0.01),符合阴虚证小鼠模型特征;黄芪生脉饮、颗粒低剂量、高剂量组以及阳性药组小鼠负重游泳时间均长于模型组,与模型组相比差异有统计学意义,特别是黄芪生脉饮、颗粒高剂量组效果最佳(p<0.001),且给药黄芪生脉饮与给药黄芪生脉颗粒所测定的力竭游泳时间结果无显著性差异,说明黄芪生脉饮、颗粒均能够改善小鼠的阴虚症状;与阳性组比较,黄芪生脉饮、颗粒高剂量组小鼠的负重力竭游泳时间无显著性差异。

图4 黄芪生脉饮、颗粒对小鼠运动能力的影响Fig.4 Effects of Huangqi Shengmai decoction and granules on exercise ability of mice

3.2.3 肌肉组织中cAMP和cGMP浓度的测定

cAMP和cGMP的拮抗性调节作用可以用中医的“阴”和“阳”来概括[23],有研究表明:阴虚时,cAMP的浓度增加,cAMP与cAMP的比值无显著性变化,这一指标常用于判定是否阴虚的依据[24]。黄芪生脉饮、颗粒对阴虚小鼠血浆中cAMP和cGMP含量的影响如表6所示。由表6可知:与正常组相比,模型组肌肉组织中cAMP和cGMP含量均升高,且差异具有统计学意义(p<0.05),cAMP与cGMP的比值增加,但无统计学意义,符合阴虚小鼠模型的特点;与模型组相比各给药组给药后,cAMP浓度降低,黄芪生脉饮、颗粒低剂量组的效果最佳(p<0.001);阳性给药组、黄芪生脉饮和颗粒低剂量给药后,cGMP浓度降低,具有统计学意义(p<0.05),黄芪生脉饮、颗粒高剂量给药后,cGMP浓度升高,但无统计学意义(p>0.05),说明黄芪生脉饮及颗粒能调节cAMP与cGMP的动态平衡。

表6 黄芪生脉饮、颗粒对阴虚小鼠血浆中cAMP和cGMP的影响

3.2.4 糖原的质量分数测定

黄芪生脉饮、颗粒对小鼠糖原质量分数的影响情况如表7所示。由表7可知:造模后模型组与正常组相比,肝脏中肝糖原质量分数显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05),该结果有待进一步探讨,肌肉组织中肌糖原质量分数降低,具有统计学意义(p<0.05);与模型组相比,阳性给药组给药后,肝糖原质量分数无明显变化(p>0.05),肌糖原质量分数增加,具有显著性差异(p<0.01);黄芪生脉饮、颗粒低剂量给药后,肌糖原质量分数降低,具有统计学意义(p<0.05),肝糖原质量分数无明显变化;黄芪生脉饮、颗粒高剂量给药后,肝糖原、肌糖原的质量分数升高,具有极显著性差异(p<0.001)。与阳性组相比,黄芪生脉饮、颗粒低剂量给药后,肝脏中肝糖原的质量分数无显著性变化,但黄芪生脉饮、颗粒高剂量给药后,肝脏中肝糖原的质量分数显著性增加,肌糖原的质量分数显著性增加,说明黄芪生脉饮、颗粒可使阴虚小鼠的肌糖原恢复,增加肝糖原的储备,且可能呈一定的剂量关系,黄芪生脉饮与黄芪生脉颗粒两组给药无显著性变化,因此低、高剂量的黄芪生脉饮、颗粒均有提高阴虚体质小鼠抗疲劳的功能。

表7 黄芪生脉饮、颗粒对小鼠糖原质量分数的影响

运动耐力是反映机体疲劳客观的指标,实验结果表明气虚、阴虚两模型黄芪生脉系列给药组的小鼠力竭游泳时间均明显长于模型组,说明黄芪生脉系列具有延缓疲劳的作用;cAMP和cGMP两者呈拮抗性共同参与细胞反应的调节,黄芪生脉颗粒可有效改善模型组小鼠cAMP和cGMP代谢紊乱问题,在一定程度上佐证了黄芪生脉系列具有益气活血,改善气虚和阴虚的功效;一般糖原的质量分数可以间接反映疲劳程度,肝糖原测定结果表明黄芪生脉系列可以明显提高肝糖原的储备量,且与模型组相比,其剂量也可提高小鼠肌糖原的量,但在阴虚模型组,与正常组相比,模型组肝糖原质量分数上升,该结果有待进一步探讨;在一定范围内体内碳颗粒被清除速率与血碳浓度呈指数函数关系,气虚模型组实验结果表明一定剂量黄芪生脉饮能够增加小鼠吞噬指数,加快碳粒廓清的速度,提示黄芪生脉饮可能通过提高机体非特异性免疫的途径来增强免疫力,提高机体对有害刺激的防御作用。笔者研究结果初步阐明了黄芪生脉系列对气虚、阴虚的作用机制,为其深入开发利用提供了参考依据,但更具体的作用机制还有待进一步研究。