JMJD6与Ki67在胶质瘤中的表达及相关性☆

曹恩栋 吕志异 蔡海平 郑建涛 杨勇 张绪超 周德祥

恶性胶质瘤的恶性生物学特性是活跃增殖和侵袭性生长，手术治疗无法做到病理学全切除，经综合治疗后仍容易复发及预后不良，研究与胶质瘤增殖与侵袭有关的基因具有重要研究意义。包含Jumonji C结构域蛋白6（Jumonji C-domain containing protein 6, JMJD6）是JmjC家族成员，具有组蛋白精氨酸去甲基化酶和赖氨酸羟基化酶活性，与肿瘤的发生、增殖、迁移、侵袭、转移等行为有关[1-3]。既往研究表明JMJD6具有促进胶质瘤细胞增殖与侵袭的作用，抑制JMJD6可延长胶质瘤动物模型的生存期及改善预后[4]，但JMJD6在不同病理级别胶质瘤之间表达的差异及其相关性如何还有待研究。Ki67是一种存在于增殖细胞核中，与细胞增殖相关的抗原，是评价肿瘤细胞增殖活性的重要标志物，Ki67的表达程度随着胶质瘤恶性度的增高而升高，与胶质瘤病例级别呈正相关[5-6]。本研究旨在探讨JMJD6与Ki67在各级别胶质瘤中的表达情况，并进一步分析JMJD6与Ki67和病理级别三者的相互相关性，为JMJD6成为胶质瘤潜在靶点和抑制胶质瘤增殖方面的研究提供依据。

1.1 研究对象 从2018至2020年我科收治的胶质瘤患者中，按病理级别及各级别发病率随机抽取46例，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级每个级别10例，Ⅳ级16例，去除Ⅱ级和Ⅳ级掉片各2例，列入最后统计共42例，其中，Ⅰ级10例、Ⅱ级8例、Ⅲ级10例、Ⅳ级14例（按胶质瘤WHO分级标准2016版），按病理级别分为四个组：Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组和Ⅳ级组。病理诊断及例数分布：毛细胞型星形细胞瘤10例，毛粘液型星形细胞瘤1例，弥漫型星形细胞瘤4例，少突胶质细胞瘤2例，多形性黄色星形细胞瘤1例，间变星形细胞瘤2例，间变多形性黄色星形细胞瘤2例，间变少突胶质细胞瘤6例，胶质母细胞瘤14例。材料和试剂：兔抗人JMJD6单克隆抗体（购于广州硕恒生物科技有限公司）、兔抗人单克隆抗体 Ki67、SP 试剂盒及 DAB 显色试剂盒均来自广州捷威斯生物科技有限公司。

1.2 胶质瘤组织中JMJD6与Ki67蛋白检测 免疫组化染色均采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（Streptavidin-Perosidase，SP）法，每个标本连续切取3张4μm厚切片，常规脱腊至水。采用SP二步法进行免疫组化染色，操作步骤参照试剂盒说明书进行，微波修复抗原，以PBS代替一抗染色作为阴性对照。

1.3 免疫组化染色定性、定量判断 JMJD6蛋白的定性分析：JMJD6蛋白的表达定位在细胞核内，细胞核内无黄染为阴性表达，淡黄色为弱阳性表达，棕黄色为阳性表达，棕褐色为强阳性表达。JMJD6检测结果按照阳性细胞数百分比评分分为5级：≤5%为0分；
＞5%～25%为1分；
＞25%～≤50%为2分；
＞50%～75%为3分；
＞75% 4分。根据细胞染色强度评分分为4级：阴性为0分；
淡黄色为1分；
棕黄色为2分；
棕褐色为3分。阳性细胞百分比评分×细胞染色强度评分=染色指数积分。分析数据时，染色指数积分 0分为-，1～4分+，5～8分++，9～12分+++[1]。JMJD6的定量表达用染色指数积分表示。Ki67蛋白的定性分析：Ki67蛋白的表达定位在细胞核内，核内呈淡黄色为弱阳性表达，棕黄色为阳性表达，棕褐色为强阳性表达。阳性细胞数比例：15%以下为+，15%～30%++，30%以上为+++。Ki67蛋白的定量分析：高倍镜（×400）下，随机选取5个高倍视野，每个视野计数200个瘤细胞，计算其阳性细胞所占百分比，取均值作为该例患者的Ki67定量值。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 25.0及 GraphPad Prism 7 统计分析。肿瘤组织中JMJD6、Ki67的阳性表达率采用单因素χ2检验；
JMJD6、Ki67蛋白表达水平采用Kruskal-Wallis检验；
JMJD6、Ki67与病理级别的相关性分析采用Pearson相关分析，关联系数以rs表示，检验水准α=0.05。

2.1 JMJD6与Ki67在不同级别胶质瘤中的定性表达 JMJD6在胶质瘤中的表达因病理级别的不同而异，Ⅰ级呈阴性或弱阳性，未见阳性或强阳性表达；
Ⅱ级的表达较多样性，阴性、弱阳性、阳性均可见；
Ⅲ级以阳性为主，少数弱阳性或强阳性；
Ⅳ级以阳性及强阳性表达为主，弱阳性极少（图1，表1）；
Ki67在胶质瘤中的表达也与病理级别有关，Ⅰ级以弱阳性为主；
Ⅱ级大多数弱阳性，少数为阳性；
Ⅲ级以阳性为主，部分强阳性，极少弱阳性；
Ⅳ级以强阳性为主，少数为阳性；
JMJD6和Ki67的阳性强度均随着病理级别的升高而增高（JMJD6：χ2=30.875，P＜0.001；
Ki67：χ2=35.292，P＜0.001）（图2，表1）。

表1 JMJD6在不同级别胶质瘤组织中的表达差异

图1 各级别胶质瘤中JMJD6的定性表达 A，Ⅰ级胶质瘤中常见JMJD6呈阴性表达（×400）；
B，Ⅱ级胶质瘤中多见JMJD6呈弱阳性表达（×400）；
C，Ⅲ级胶质瘤中多见JMJD6呈阳性表达（×400）；
D，Ⅳ级胶质瘤中多见JMJD6呈强阳性表达（×400）。

图2 Ki67在不同级别胶质瘤中的定性表达×400 A，Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤常见Ki67呈（+）；
B，Ⅲ级胶质瘤中多见Ki67呈（++）；
C，Ⅳ级胶质瘤中多见Ki67呈（+++）。

2.2 JMJD6与Ki67在不同级别胶质瘤中的定量分析 JMJD6与Ki67的表达水平不满足正态性和方差齐性，JMJD6表达的中位数为Ⅰ级0.05，Ⅱ级4.50，Ⅲ级7.50，Ⅳ级8.00，JMJD6的表达水平随着胶质瘤级别的增加而升高，级别间的差异有统计学意义（H=25.397，P＜0.001）（图 3，表 2）。Ki67表达的中位数为Ⅰ级0.010，Ⅱ级0.050，Ⅲ级0.325，Ⅳ级0.550，Ki67的表达水平也随着胶质瘤级别的增加而升高，级别间的差异有统计学意义（H=30.804，P＜0.001）（图4，表2）。

表2 不同级别胶质瘤JMJD6、Ki67的表达水平的差异

2.3 JMJD6和Ki67与胶质瘤病理级别的相互相关性分析 JMJD6的表达水平与胶质瘤级别间呈正相关（r=0.782，P＜0.001）（图3）；
Ki67的表达水平与胶质瘤级别间呈正相关（r=0.852，P＜0.001）（图4）；
胶质瘤中JMJD6与Ki67的表达水平也呈正相关（r=0.709，P＜0.001）（图5）。

图3 各级别胶质瘤中JMJD6的表达水平（中位数）的趋势 JMJD6的表达水平与胶质瘤级别间呈正相关（r=0.782，P ＜0.001）。

图4 各级别胶质瘤中Ki67表达水平（中位数）的趋势及差异Ki67的表达水平与胶质瘤级别间呈正相关（r=0.852，P＜0.001）。

图5 胶质瘤中JMJD6与Ki67表达的相关性分析 胶质瘤中JMJD6与Ki67的表达水平呈正相关（r=0.709，P＜0.001）。

JMJD6是一个具有赖氨酸羟化酶活性和酪氨酸激酶活性双重作用的加氧酶，既发挥催化赖氨酸的羟基化和精氨酸组蛋白与非组蛋白多肽的乙基化作用[1-2]，也起内在的酪氨酸激酶活性作用[3]。JMJD6作为一个癌基因，与许多恶性肿瘤的发生、增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为有关[7-10]。JMJD6参与胶质瘤的形成[4]，且与胶质瘤干细胞的增殖与侵袭有关[11]。本研究结果显示，JMJD6在胶质瘤中的表达水平与胶质瘤病理级别密切相关，虽然可以表现为阴性、弱阳性、阳性及强阳性表达。但是，随着病理级别的递增，JMJD6的表达水平也呈逐渐升高趋势，在各级别胶质瘤的表达不全相同，JMJD6的表达水平与病理级别相关性分析结果也提示两者存在正相关。上述两方面研究结果均说明JMJD6与胶质瘤的病理性质即恶性程度密切相关。由此，可预测JMJD6与胶质瘤患者预后可能存在相关性，这值得我们下一步进一步深入探讨。当然，我们也发现在Ⅱ级别胶质瘤中JMJD6的表达呈现多样，阴性表达、低表达及高表达均可见，有可能是Ⅱ级别入组例数少，存在误差，也可能是以前病理级别分型采用上一个旧版本分级，该旧版本中有少数Ⅱ级别胶质瘤，如进一步检查H3K27M（+），则在2021年新版本分型中归入Ⅳ级，因此，也可能产生误差。本研究为回顾性分析，无法采用最新版本分级，是本研究的不足之处。

既往研究表明JMJD6与肺癌、乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤的预后呈负相关[12-13]。抑制JMJD6可抑制恶性肿瘤的增殖与侵袭[14]；
且抑制JMJD6可提高肿瘤动物模型的生存时间[15]。较多证据提示JMJD6有可能成为恶性肿瘤的潜在治疗靶点[16-17]。也有研究提示JMJD6与胶质瘤的形成有关[4]，且可促进神经胶质瘤干细胞的增殖与侵袭[11]，由于胶质瘤干细胞是导致胶质瘤复发、放化疗耐药、增殖、侵袭等行为的重要原因之一。因此，抑制JMJD6可能起抑制胶质瘤干细胞的作用，从而抑制胶质瘤的复发、增殖生长、侵袭等恶性行为。因此，JMJD6除了可预测胶质瘤恶性程度及增殖指数外，暗示其可能是个潜在治疗靶点，这值得下一步深入研究。

Ki67是一种存在于细胞核，与细胞增殖密切相关的核蛋白。Ki67的表达反映细胞核增殖活性，自细胞进入G1期开始表达，在G2、M期表达最强，G0期不表达。目前，成为检测细胞增殖指数的指标。作为评价增殖细胞的经典标记物[18]，主要用于判断肿瘤细胞的增殖活性，Ki67的阳性率越高，说明处于增殖周期的细胞比例越高，肿瘤生长越快；
一般来说，Ki67的阳性率越高，其预后越差[19]。

本研究结果表明，Ki67的表达水平随着胶质瘤级别的增高而升高，在不同级别胶质瘤中的表达呈现不全相同，Ki67的表达水平与病理级别进行相关性分析结果也显示两者呈正相关。两个研究结果与既往文献研究结果是一致的[18]，可以认为，Ki67能够作为胶质瘤组织病理分级及预测预后的客观指标。

JMJD6与Ki67这两个与增殖有关的标记物，两者的表达水平均随着胶质瘤级别的增高而升高，两者与病理级别均呈显著正相关。在进一步对JMJD6与Ki67两者的表达水平进行相关性分析显示两者的表达水平也呈显著正相关关系，说明JMJD6和Ki67在促进胶质瘤恶性增殖方面可能存在相互作用关系或协同作用关系；
再次提示两者均可能是胶质瘤病理分级和预测预后的客观指标。

本研究仅探讨JMJD6和Ki67在各级别胶质瘤中的表达及三者的相互相关性，但未阐明JMJD6和Ki67对胶质瘤增殖情况的影响及JMJD6和Ki67对胶质瘤预后的关系，这是本研究的不足之处，我们将在以后的研究中进一步深入探讨。