SFN通过Nrf2信号通路缓解ACAC诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激

唐 燕，罗胜缤，孙旭东，徐 闯

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)

酮病是奶牛围产期常见的代谢性疾病，由于泌乳所需能量增加而干物质摄入量(dry matter intake，DMI)降低，通常表现出能量负平衡(negative energy balance，NEB)[1]。为适应NEB，机体启动脂肪动员产生大量游离脂肪酸以满足能量需求[2]，进而产生大量酮体，导致高酮血症从而引发酮病。酮病奶牛处于氧化应激状态，且与酮病奶牛代谢产生的高浓度酮体密切相关。此外，高浓度的酮体可引起奶牛乳腺组织氧化应激并造成氧化损伤[3]，进而影响奶牛乳腺组织的泌乳功能，最终导致产奶量降低和乳品质下降，严重制约我国奶业的发展。乙酰乙酸(acetoacetic acid,ACAC)是奶牛体内酮体的主要形式之一，高浓度的ACAC可促进ROS的产生诱导氧化应激[4]。乳腺上皮细胞是奶牛乳腺组织泌乳的基本功能单位，维持其正常生理功能对奶牛生产性能至关重要。因此，如何缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤并探索其潜在治疗靶点及药物是我国奶业发展的迫切需求。

核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor E2-reated factor 2,Nrf2)是一种参与调控细胞氧化还原平衡的转录激活因子[5]。目前，Nrf2是研究细胞保护反应分子机制的热门靶点。通常，Nrf2与细胞质中的Kelch-like ECH相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)以复合物形式存在[6]。在细胞发生氧化应激时，Nrf2从Keap1中释放出来并移位到细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant responseelement，ARE)结合，激活包括NQO1和HO-1在内的细胞抗氧化基因的转录[7-8]，从而发挥抗氧化作用。据报道，激活Nrf2信号通路可以缓解H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激[9-10]。

萝卜硫素(SFN)是存在于花椰菜等十字花科蔬菜中的一种天然的异硫氰酸酯，在抗氧化、抗炎等细胞保护反应中发挥着重要作用[11]。此外，SFN是Nrf2的天然植物化学激活剂，因其对氧化应激和慢性炎症引起的疾病可起到预防和治疗作用[12]，被广泛应用于食品添加剂。与其他植物源性的化学补充剂(如姜黄素、水飞蓟素和白藜芦醇)相比，SFN可以更有效地激活Nrf2，诱导一系列细胞保护基因的表达[13]。发生氧化应激时，SFN可激活Nrf2/ARE抗氧化途径，从而促进抗氧化基因的表达，如HO-1和NQO1等[14]。研究表明，SFN可通过促进Nrf2的核移位来缓解H2O2诱导的人肝细胞氧化应激损伤[15]。这些研究说明SFN可以通过激活Nrf2信号通路从而缓解氧化应激，但尚不清楚SFN是否可以通过激活Nrf2信号通路从而缓解ACAC诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激。

因此，本试验通过对奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T添加不同浓度的ACAC，建立酮病奶牛氧化应激模型，并添加10 μmol/L的SFN，检测Nrf2蛋白相对表达情况及其下游基因HO-1和NQO1基因表达水平，并检测ROS和MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性，旨在探讨SFN保护奶牛乳腺上皮细胞免受ACAC诱导的氧化应激的分子调控机制，为防治酮病奶牛代谢应激导致的乳腺组织氧化损伤提供理论依据。

1.1 主要试剂及仪器DMEM-F12培养基(Hyclone公司)；
胎牛血清(CLARK公司)；
RIPA细胞组织裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒和ROS检测试剂盒均购自碧云天公司；
TRIzol和RNA反转录试剂盒购自TaKaRa；
SYBR green plus(Roche，Norwalk，CT)；
MDA含量检测试剂盒及SOD和GSH-Px活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；
Nrf2抗体(Abcam)；
GAPDH抗体(absin)；
二抗(博士德)；
ECL化学发光溶液(Pierce Biotechnology Inc.)；
流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson)；
722N分光光度计(上海精密仪器有限公司)；
荧光定量PCR仪(7500 Real-Time PCR系统Applied Biosystems)；
Amersham Imager 600化学发光成像仪(美国GE的Fujifilm光学系统)。

1.2 细胞培养及处理本试验使用的奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)购自上海传秋生物科技有限公司。用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM-F12培养基，在37℃、5%CO2的条件下培养MAC-T，每隔24 h更换培养基1次。用0，0.6，1.2，1.8 mmol/L ACAC分别处理MAC-T细胞24 h。用10 μmol/L SFN处理MAC-T细胞24 h后再用1.2 mmol/L ACAC处理24 h。

1.3 检测指标

1.3.1ROS的测定 采用DCFH-DA染色法检测ROS。用25 μmol/L DCFH-DA处理细胞并孵育20 min,然后用无血清培养基洗涤细胞3次，收集细胞重新悬浮于台式液中，使用流式细胞仪测定荧光,细胞内ROS浓度为相对荧光。

1.3.2氧化应激指标的测定 将原细胞培养液弃掉后每孔加入1 mL PBS清洗，然后收集细胞，按照试剂盒说明书测定细胞中MDA的含量，使用722N分光光度计在532 nm(MDA)处读取D值；
根据试剂盒说明书检测GSH-Px和SOD的活性，分别在560 nm(SOD)和420 nm(GSH-Px)处读取D值。

1.3.3RNA分离和实时定量PCR(qPCR) 细胞在六孔板中处理结束后，按照每孔1 mL的量加入TRIzol，用移液枪吹打数次并收集细胞于无RNA酶的EP管中。之后按照加入氯仿抽提—离心—加入异丙醇沉淀—离心—酒精洗涤—离心的步骤提取细胞总RNA。根据RNA浓度，将1 μg RNA样品使用试剂盒反转录为cDNA。使用SYBR green plus试剂盒在7500 Real-Time PCR系统检查靶基因的表达量；
在Excel软件中用2-△△Ct方法计算目的基因的表达水平。本研究中所用全部引物见表1。

表1 Real-time PCR分析所用引物

1.3.4Western blot 细胞处理结束后收集细胞，加入适量细胞组织裂解液RIPA，振荡后在冰上静置，10 min/次，共振荡3次。振荡结束后将悬液离心并收集上清液，按照BCA法的步骤测定蛋白质量浓度并调整质量浓度加入loading buffer制成蛋白样品。使用10%浓度的SDS-PAGE将30 μg蛋白在80 V、30 min和120 V、60 min条件下电泳分离。将完成电泳后的目的蛋白转至PVDF膜上，然后将膜放入5%脱脂奶粉溶液中，室温条件下封闭2 h。4℃摇床孵育一抗过夜。一抗孵育结束后，使用含1%Tween 20和10%TBS的TBST缓冲溶液洗涤5次，每次5 min；
然后在室温条件下水平摇床孵育二抗1 h；
TBST洗涤5次，每次5 min；
最后在Amersham Imager 600化学发光成像仪中将膜曝光成像。将得到的目的蛋白条带进行灰度分析，并进行统计学比较后制作成柱状图。

1.4 统计学分析采用IBM SPSS Statistics 26.0软件对各组试验数据进行单因素方差分析，各组间的显著性差异用字母表示(P<0.05)，数据表示形式为平均数±标准误。

2.1 ACAC诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化应激与对照组相比，1.2，1.8 mmol/L ACAC处理组MAC-T细胞中ROS和MDA含量显著升高(图1，P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性显著降低(图2，P<0.05)。

A.ROS含量；
B.MDA含量。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2 SFN预处理缓解ACAC对Nrf2信号通路活性的抑制作用与DMSO组相比，ACAC+DMSO处理组的Nrf2蛋白水平显著降低(图3A，B;P<0.05)。然而，与DMSO组相比，SFN处理组Nrf2蛋白表达水平显著升高(图3，P<0.05)。与ACAC+DMSO处理组相比，ACAC+SFN处理组Nrf2蛋白表达水平显著升高(图3,P<0.05)。与DMSO组相比，ACAC+DMSO处理组的Nrf2下游基因HO-1和NQO1 mRNA表达量显著降低(图4,P<0.05)。与DMSO组相比，SFN处理组HO-1和NQO1 mRNA的表达量显著升高(图4,P<0.05)；
与ACAC+DMSO处理组相比，ACAC+SFN处理组HO-1和NQO1 mRNA表达量显著升高(图4A,B；
P<0.05)。

A.Nrf2蛋白表达；
B.Nrf2蛋白相对水平

A.HO-1基因表达水平；
B.NQO1基因表达水平

2.3 SFN预处理缓解ACAC诱导的氧化应激与DMSO组相比，ACAC+DMSO处理组的MAC-T细胞中的ROS和MDA含量显著升高(图5,P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性显著降低(图6,P<0.05)。与ACAC+DMSO处理组相比，ACAC+SFN处理组的MAC-T细胞中的ROS和MDA的含量显著降低(图5,P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性显著升高(图6,P<0.05)。

A.ROS含量；
B.MDA含量。

A.SOD活性；
B.GSH-Px活性

酮病奶牛乳腺组织存在严重的氧化应激，导致乳腺上皮细胞氧化损伤，降低奶牛泌乳性能[3]。因此，增强奶牛乳腺组织的抗氧化能力是缓解氧化应激导致的氧化损伤以及增强泌乳性能的有效治疗策略。SFN是一种广泛存在于十字花科蔬菜家族的Nrf2的天然激活剂，具有很强的抗氧化作用[16]。本试验结果表明，SFN具有激活Nrf2信号通路来抵抗ACAC诱导的氧化应激的生物学活性。因此，我们推测SFN可能是一种潜在的预防和治疗反刍动物氧化损伤的药物。

酮病奶牛泌乳早期因发生NEB存在严重的代谢应激[17]。此时，因泌乳所需能量大幅提高，大量游离脂肪酸和酮体随血液进入乳腺组织以满足能量需求[18]。ACAC是酮体的主要形式之一，高浓度酮体导致奶牛乳腺组织氧化损伤[19-20]，损害乳腺泌乳功能。这是由于大量酮体诱导过量的ROS产生导致抗氧化能力降低造成氧化还原失衡从而引发氧化应激，最终导致细胞脂质、蛋白质和DNA发生氧化对周围组织造成实质性的损害[21]。因此，对于围产期奶牛而言，维持细胞内氧化还原平衡是抵御氧化应激相关疾病的关键所在。SFN是一种PhaseⅡ型酶的天然诱导剂，能有效地诱导HO-1和NQO1等抗氧化酶，增强细胞和器官抵御各种氧化应激损伤的抗氧化能力[22-23]。本试验结果表明，SFN预处理缓解了ACAC对抗氧化酶SOD和GSH-Px活性的抑制作用，并增强了HO-1和NQO1基因的表达，这些结果强调了SFN有益于增强细胞抗氧化系统的防御能力。此外，ROS和MDA浓度降低也说明了SFN可增强奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力，从而缓解ACAC诱导的氧化应激。然而，目前尚不清楚ACAC诱导的MAC-T氧化应激模型是否能够模拟围产期酮病奶牛体内的氧化应激状态。因此，应进一步研究SFN对酮病奶牛乳腺组织氧化还原状态的调节作用。

SFN的抗氧化能力源于激活Nrf2信号通路以促进抗氧化基因的转录[24]。内源性抗氧化防御机制包括SOD、GSH-Px和HO-1等多种Ⅱ相抗氧化酶[25-26]。这些抗氧化酶的表达受抗氧化反应原件ARE启动子序列的调控，而ARE受Nrf2转录因子的调控[27]。Nrf2必须移位到细胞核中与ARE结合才能启动Ⅱ相抗氧化酶的转录[28]。有研究表明，SFN通过激活Nrf2-ARE途径，上调抗氧化酶基因的表达清除过多的ROS，来保护颗粒细胞免受氧化应激损伤[29]。ZHAO等[30]发现,SFN通过激活Nrf2来激活HO-1，减轻脓毒症导致的氧化应激，从而缓解大鼠急性肺损伤。CHEN等[31]研究表明，SFN通过诱导Nrf2介导的抗氧化反应保护神经嵴细胞抵御乙醇诱导的氧化应激。以上结果都强调了SFN通过激活Nrf2途径来抑制氧化应激诱导的氧化损伤的作用。在本试验中，SFN预处理减弱了ACAC对Nrf2的表达以及Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA水平的抑制作用,并且SFN预处理降低了活性氧ROS和细胞毒性产物MDA含量，也提升了细胞的抗氧化酶活性。这些结果说明SFN可以通过激活Nrf2，从而增强奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力来缓解氧化应激，与其他研究的结果是一致的。因此，本试验的结果表明SFN通过激活Nrf2增加抗氧化酶活性来减轻ACAC诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激。目前，SFN提取纯化工艺的发展日益成熟，可实现工业化大规模生产[32]。因此SFN作为天然植物的抗氧化性膳食补充剂，具备良好的市场应用前景并为未来奶牛临床疾病的防治提供了新的方向和手段。

本试验结果表明，SFN可以缓解ACAC诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激。SFN通过增加Nrf2的蛋白表达及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA水平，并增强抗氧化酶活性，降低ROS和细胞毒性产物MDA的含量，从而发挥抗氧化作用。综上，SFN通过激活Nrf2信号通路，增加抗氧化基因的表达并增强奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力，缓解ACAC诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激。