CNV-Seq技术和羊水细胞染色体核型检测在产前羊水穿刺中的价值比较

向丹丹，牛凤鹤

（南阳市第二人民医院，河南 南阳 473000）

产前羊水穿刺检测多用于血清学检测、影像学诊断存在明显异常孕妇，可明确染色体质量，评估胎儿健康程度，对保证孕育质量具有积极意义[1-2]。羊水细胞染色体核型检验为胎儿染色体异常诊断金标准。但在取样过程中易受样本污染而影响检测质量，且羊水穿刺操作时间较长、技术要求较高，难以满足孕妇快速诊断需求；
同时此种诊断技术对染色体分辨率较低，影响诊断效果[3]。随着基因学的发展，在产前羊水细胞检测中，基因组拷贝数变异测序（CNV-Seq）技术应用频率逐渐提升，对致病性CNVs检出灵敏度高，但对部分染色体结构异常诊断检出率相对有限[4]。为此，本次研究选取于我院接受羊水穿刺检测孕妇59例为研究对象，探究以上两种检测方案的临床价值。现报道如下。

1.1 一般资料 选取2021年1月—2021年6月期间于我院接受羊水穿刺检查孕妇59例，年龄18～42岁，平均（29.12±3.33）岁；
孕周18～28周，平均（20.25±3.24）周；
孕次1～5次，平均（2.63±0.30）次；
产次0～3次，平均（1.82±0.30）次。

纳入标准：唐氏筛查高风险者；
年龄≥35岁；
无创DNA高风险者；
超声检查显示鼻骨缺失、脉络丛囊肿、肠管增宽、颈部透明层厚度≥2.5 mm者；
孕期不良接触者；
既往染色体异常儿孕育史者；
其他怀疑染色体异常孕妇。排除标准：有干细胞、移植手术治疗史者；
1年内输血史者；
多胎；
无明确产前指征者。

1.2 方法 收集孕妇30 mL羊水样本，分为3份（2份12 mL，1份6 mL），其中2份12 mL羊水样本进行羊水细胞G显带核型双线培养，6 mL样本羊水细胞DNA提取后，完成高通量基因测序检测。

羊水细胞染色体核型检测方法：样本加入15 mL试管中，离心（1500 r/min，10 min），弃去上清液，分别加入0.5 mL培养基混匀制备单细胞悬液，接种于两个T25无菌细胞培养皿中，细胞培养条件：37℃、5% CO2；
培养9 d时第一次换液；
培养瓶中存在15个以上分散均匀、贴壁生长的克隆细胞，以圆形、折光性强分裂细胞为主时，加秋水仙碱进行细胞处理，并进行G显带（分辨率＞10 M）操作；
对显带后细胞染色体以MetaSystems全自动染色体扫描分析仪进行核型扫描。

CNV-Seq技术检测方法：取6 mL羊水样本，离心（1500 r/min，10 min），弃上清液，提取50 ng基因组DNA为模板构建测序文库，纯化DNA文库浓度（≥10 pM）后，应用BGISEQ-500测序仪进行样本细胞低深度高通量测序，获得染色体Z值及全部＞100 Kb染色体基因组拷贝数变异；
将获得＞100 Kb染色体基因组拷贝变异与在线人类孟德尔遗传数据库、人类染色体变异数据库等数据库中已有数据比对，结果依据美国医学遗传学与基因组学会（ACMG）指南为标准。

1.3 观察指标 （1）比较两种检验方法的检测成功率和对异常染色体阳性检出率。（2）比较两种检测中未能有效检出的检测结果。

1.4 统计学处理 应用SPSS21.0软件进行数据分析，计量资料以x± s 表示，采用t检验；
计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；
以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.1 两种方法未能有效检出的检测结果比较CNV-Seq技术对染色体结构异常未能成功检出，羊水细胞染色体核型对致病性未知CNVs未能成功检出。见表1。

表1 两种方法未能有效检出的检测结果比较

2.2 两种检测方法对异常染色体阳性检出率比较 CNV-Seq技术检测成功率为100.00%，羊水细胞染色体核型检出率为98.31%，两组比较，P＞0.05；
CNV-Seq技术阳性率为20.34%，羊水细胞染色体核型阳性率为16.95%，两组比较，P＞0.05。见表2。

表2 两种检测方法对异常染色体阳性检出率比较[ n（%）]

羊水穿刺获得胎儿细胞后，进行细胞培养、细胞遗传学-染色体G显带核型分析，为产检中高危孕妇主要检测方法。但在其检测中，操作较为繁琐，对实验室人员专业技术要求较高[5]，细胞培养过程中易受到污染，实验要求较严格，难以满足批量检测的要求，结果检出时间较长，一般需要孕妇等待两周左右。等待结果期间会使孕妇产生较大的心理压力，难以满足临床诊断需求[6]。

随着分子生物快速发展，CNV-Seq技术在临床检验中应用频率逐渐提升，通过高通量基因测序技术（NGS），对羊水中胎儿细胞进行低深度高通量基因测序，并与基因库进行比对，以发现样本中基因拷贝变异情况[7]。与羊水细胞染色体核型检测办法相比，CNV-Seq技术的主要优势为能够实现全基因覆盖；
一次上机可完成≥80份样本检测，可满足批量检测需求；
操作相对简单，完成报告时间较短，一般2～3 d即可出检测结果，满足产妇快速检出需求；
检测样本量较低，检测精密度较高[8]。

本次研究中，对59例接受羊水穿刺检验孕妇进行以上两种检验，结果显示，两种检验方法在染色体异常阳性检出率及检测成功率比较中，差异均无统计学意义，说明在羊水样本检验中CNVSeq技术可获得与羊水细胞染色体核型检验相似的检验结果，证实CNV-Seq技术在临床检验中的重要性。但在研究中发现，CNV-Seq技术对染色体结构异常未能成功检出，分析其原因为：染色体平衡易位、倒位时，并未发生遗传物质丢失、增加情况，因此，无法通过CNV-Seq技术成功检出；
而羊水细胞染色体核型通过细胞遗传学-染色体G显带核型分析，可对不同染色结构异常情况有效检出。因此，在对染色体结构检查中，需以羊水细胞染色体核型结果为主。本次研究结果显示，羊水细胞染色体核型对致病性未知CNVs未能成功检出，分析其原因为：两种检测技术均能够成功检测染色体非平衡性、非整倍体染色体异常情况，而与羊水细胞染色体核型比较，CNV-Seq技术可检出更多致病染色体异常；
同时CNV-Seq技术对检测基因覆盖范围更广，低浓度样本DNA均可被有效检出，因此，能够检出更多致病基因型。李翠[9]在研究中发现，CNV-Seq技术、羊水细胞染色体核型对异常染色体检出率比较中，未见明显差异（16.67%vs19.04%），与本次研究结果相近，证实在产前羊水细胞基因学检验中CNV-Seq技术具有积极检验价值。但因两种检测办法单独检验时，均存在一定局限性，因此在实际临床检验中，建议两种检测技术同时开展，以保证检验质量。

综上所述，在产前羊水穿刺检测中，羊水细胞染色体核型、CNV-Seq技术检测成功率及阳性检出率比较中无明显差异，可以考虑两种检测办法联合实现互补，提升检测质量。