西藏白肉灵芝三萜高效液相检测分析及含量测定

谢 荣，韩俊杰，宝 丽，刘宏伟

(1.西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所，西藏 拉萨 850032；
2.中国科学院微生物研究所，北京 100000)

西藏白肉灵芝自2014 年在拉萨国家农业科技示范园区驯化栽培成功[1]后，在拉萨市曲水县聂当乡、才纳乡，林芝市巴宜区、工布江达县巴河镇、米林县、波密县的脱贫攻坚中发挥了重要作用。三萜作为白肉灵芝的主要药效成分[2-7]，白肉灵芝相关产品的开发，需提供品质稳定的原料，不同生长环境对其三萜成分有何影响目前尚无研究。因此，本研究采用化学分光光度法和高效液相色谱(HPLC)，测定和分析了孢子粉、液体发酵和不同来源的子实体中三萜含量和组分种类。有研究指出，在赤芝生长初期即原基期，喷施一定剂量的水杨酸会刺激子实体中三萜的生成[8，9]，水杨酸是否对白肉灵芝的三萜合成有同样作用，目前均尚未有报道。本研究为栽培白肉灵芝三萜的开发利用及质量控制和标准化提供依据。

供试样品见表1。

表1 供试样品列表

1.1 总三萜含量测定方法：

(1)将白肉灵芝子实体放在50 ℃的烘箱，20 h后取出，粉碎，过60目的筛备用。

(2)供试品溶液的制备 取(1)的样品5 g，精密称定，置于圆底烧瓶，加入100 mL 乙醇，回流提取2 h，滤去滤渣，即得供试品溶液。

(3)对照品溶液的制备 取齐墩果酸对照品20.00 mg，加甲醇定容至100 mL，即得0.20 mg/mL的对照品溶液。

(4)显色方法 灵芝总三萜含量的测定采用冰醋酸-香草醛法。精密量取供试品溶液或对照品溶液置于15 mL 具塞试管中，挥干，放冷，精密加入现配的冰醋酸-香草醛溶液(精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)、0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀，在70 ℃水浴中加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在546 nm波长处测定吸光度。

(6)标准曲线的制备 按照中国药典的方法：精密量取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，0.6 mL，0.8 mL，分别置15 mL具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛-冰醋酸溶液(精密称取香草醛0. 5g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)0.2 mL 高氯酸0.8 mL，摇匀，在70 ℃水浴中加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在546 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。得到线性回归方程为y=5.4062x-0.0403，相关系数R=0.999 5，表明方程拟合度较好。

1.2 HPLC分析方法：

流速：1 mL/min，色谱柱：YMC，C18，250 min×4.6 mm，检测波长254 nm，高效液相洗脱流程见表2。

表2 高效液相洗脱流程

图1 结果显示，在连作2 年的前提下，2019 年栽培的白肉灵芝三萜质量比下降明显，2020 年栽培的白肉灵芝三萜质量比又有所恢复，为16.8 mg/g。

图1 2017—2020年连作栽培三萜含量变化

根据三萜来源和结构差异将液相图谱三萜组分划分为：混源萜类化合物、白肉灵芝特有灵芝三萜、传统灵芝三萜、三萜法尼基复合物类，其中传统灵芝三萜即为赤芝常见的种类。表3和图2结果显示，孢子粉中三萜含量较低，只有极少量的混源萜类化合物、传统灵芝三萜及三萜法尼基，基本不含白肉特有灵芝三萜，丰富程度低。

表3 供试样品三萜含量

续表

续表

图2 孢子粉三萜组分

图3 结果显示，发酵菌丝体中含有少量的传统灵芝三萜及三萜法尼基复合物化合物，而发酵液乙酸乙酯萃取后旋蒸部分中几乎不含三萜化合物。

图3 液体发酵培养三萜组分

图4 结果显示，乃东和波密的混源萜类化合物、白肉特有灵芝三萜、传统灵芝三萜及三萜法尼基的化合物成分组成基本没有差异，巴河的三萜化合物丰富度高于乃东和巴河。

图4 不同栽培地三萜组分差异

表3、图1 和图5 结果显示，在连作两年前提下，2019 年栽培的白肉灵芝三萜质量比下降明显，2020 年栽培的白肉灵芝三萜质量比又有所恢复，为16.8 mg/g。

图6 结果显示，白肉特有灵芝三萜和传统灵芝三萜化合物在林芝1-5 号中相对含量较高，林芝2号、5号三萜含量较高与液相图谱结构一致。

图7 结果显示，同一栽培地，不同颜色子实体白肉灵芝特有灵芝三萜、传统灵芝三萜及三萜法尼基复合物的含量在中基本没有差异。

图8 和图9 结果表明，水杨酸蕾期喷施浓度100 μmol/L时三萜质量比增加显著。

图9 2020年水杨酸蕾期喷施诱导试验

图10结果表明，5号棚中白肉特有灵芝三萜和传统灵芝三萜化合物相对含量较高，其中5 号棚水杨酸100 三萜质量比最高，水杨酸混合部分三萜质量比略低。

图10 5号棚水杨酸诱导试验三萜组分差异

图11 结果表明，灵芝CK，100，200，400，800，1600 样品间成份差异不大，其中传统灵芝三萜相对质量比最丰富，灵芝100总三萜质量比略高。

图11 2020年水杨酸诱导试验三萜组分差异

孢子粉、液体发酵培养均不如子实体栽培三萜含量高，组分丰富；
同一产地连作三萜含量有下降趋势，与不同产地、不同来源栽培种同一地栽培比较，在组分上丰富度也明显下降，尤其是白肉灵芝特征三萜几乎没有。浓度为100 μmol/L 的水杨酸蕾期诱导喷施试验总三萜含量略高，组分差异不大，其中传统灵芝三萜相对含量最丰富，说明水杨酸诱导三萜生物合成有一定作用，只能刺激部分白肉灵芝特有三萜组分形成。