红花查尔酮合成酶基因的克隆、结构及表达分析

鲁丹丹，谭政委，杨红旗，李 磊，余永亮，许兰杰，杨 青，梁慧珍

（河南省农业科学院 芝麻研究中心，河南 郑州 450002）

红花（Carthamus tinctoriusL.）是菊科1 年生草本植物，是菊科较大的家族之一。菊科植物比如蒿、莴苣和菊花等，大多具有药用、观赏或经济价值[1⁃3]，红花的干燥花瓣也是很重要的一种传统中草药，被广泛用于治疗经闭、胸痹心痛、跌扑损伤、疮疡肿痛等症，有活血通经、散瘀止痛的功效[4]。研究表明，红花含有丰富的喹诺查尔酮、黄酮类化合物、脂肪酸、生物碱及各种酚类化合物，且喹诺查尔酮和黄酮类化合物通常被认为是红花发挥疗效的主要生物活性成分[5]，比如红花对心血管系统的药理作用是通过黄酮类化合物激活抗氧化防御和清除自由基实现的[6]。因此，红花黄酮代谢途径的研究有助于提高红花的品质和利用价值。

黄酮类化合物是苯丙氨酸代谢途径衍生的次生代谢产物，是植物体内常见的天然化合物，功能具有多样性，比如色素沉着、紫外线保护、病原菌防御等[7]。此外，大量研究表明，黄酮类化合物还有多种药用价值，如抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力、镇痛等药理活性[8⁃11]，富含黄酮类化合物的食物还可以降低不同肿瘤的风险，预防慢性疾病[12]。黄酮类化合物结构多样、种类繁多，在植物体内既可以与糖结合成苷类或碳糖基，也可以游离形式存在。繁多的种类及复杂多变的结构使得不同植物体内黄酮代谢途径不尽相同。目前，拟南芥等模式植物中黄酮生物合成的代谢途径已基本明确[13]。然而，红花中黄酮类化合物的生物合成仍然未知，确定红花黄酮类化合物生物合成的相关基因，对利用分子技术促进红花活性成分的合成具有重要意义。

查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）属于植物类型Ⅲ聚酮合酶超基因家族，是黄酮类化合物合成过程中的第1 个限速酶。查尔酮合成酶催化3分子丙二酰辅酶A 与1 分子香豆酰辅酶A 经脱羧缩合成4′，5，7-三羟基黄烷酮型查尔酮，进一步合成查尔酮、色酮、吡喃酮、姜黄素和吖啶酮等开花植物中重要的功能化合物[14]。自首个CHS基因从欧芹中分离出来，近年来从单子叶及双子叶植物中分离鉴定了将近650 个CHS及CHS类的基因[15]，其中包括近20种中草药的CHS基因，比如铁皮石斛、艾纳香、苦蘵、白芨等[15⁃18]。CHS 超家族通常以多基因家族的形式存在。目前，已发现的CHS基因在水稻中有27个，玉米中14个，海岛棉中20个，甘蔗中7个[19⁃22]，而2021年红花的基因组测序数据表明，红花中至少有7个CHS基因[23]。2016 年，SHINOZAKI 等[24]克隆了3个CtCHS基因，并对其进行了功能分析；
2017年，刘秀明等[25]将CtCHS基因导入拟南芥，发现其在拟南芥中超表达后提高了拟南芥黄酮含量；
2018年，何贝轩等[26]发现了1 个CtCHS基因，其可以响应茉莉酸甲酯诱导，促进红花醌式查尔酮类化合物的积累。然而未见对CtCHS基因结构、内含子信息及不同品种、组织、发育时期表达量的分析报道。河南省农业科学院芝麻研究中心药用植物研究室在前期研究中已构建了不同花色红花三代测序全长转录组数据库，在此基础上，本研究拟通过RT-PCR及PCR 方法克隆CtCHS基因的cDNA 及gDNA 序列，对其基因结构、内含子及外显子序列、蛋白质结构及系统进化关系进行分析，并检测该基因在不同花色的红花、不同组织及不同发育时期花中的表达量，分析不同激素胁迫下该基因的表达模式，为解析红花黄酮类物质的生物合成途径及应用分子技术提高红花黄酮类物质含量提供理论基础。

1.1 试验材料

所用红花材料包括红色红花（管状花为红色）和白色红花（管状花为白色）2 种，均由河南省农业科学院芝麻研究中心提供，种植于河南省农业科学院河南现代农业研究开发基地（东经113°42′，北纬35°01′，海拔63.40 m），自然条件下生长。于不同生长期，在田间采取红色和白色红花幼根、幼茎、幼叶、苞片和不同开花时期的花瓣各3个生物学重复，置于液氮中速冻处理，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 激素处理及取样 将红色红花种植于河南省农业科学院现代农业研究开发基地，自然条件下生长至开花的第1天时，对其果球进行激素处理。分别取茉莉酸甲酯（100µmol/L）、赤霉素（100µmol/L）、脱落酸（100 µmol/L）、生长素（100 µmol/L）溶液各5 mL，均匀喷洒至果球表面，并立即用干净的塑料袋套住。每个处理选取5株红花，在处理后的0、3、6、12、24 h采集不带苞片的花瓣，液氮速冻后，-80 ℃保存备用。

1.2.2 gDNA 和总RNA 的提取及cDNA 第1 链合成 于红色红花幼苗3～5叶期，取无病斑、无损伤的鲜叶，采用北京华越洋生物科技有限公司的植物基因组DNA 提取试剂盒提取红色红花gDNA；
使用北京华越洋Quick RNA Isolation Kit 试剂盒提取红色和白色红花不同组织、不同发育时期花及红色红花不同激素处理的总RNA。具体操作步骤详见试剂盒说明书。

利用1.1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的质量、完整性，使用NanoDrop 2000 分光光度计测定其浓度。

使用反转录试剂盒（TaKaRa，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）将总RNA 反转录为第1 链cDNA，反转录操作步骤详见说明书（Code No.RR047A）。

1.2.3CtCHS基因cDNA 和gDNA 序列的克隆 以本研究室前期不同花色红花转录组测序获得的Unigene 基因序列Uni8569 为参考序列，使用Primer Premier 5 软件设计特异性引物（表1），分别以红色红花花瓣cDNA 和gDNA 为模板，使用KOD酶进行PCR 扩增。扩增体系20 µL：2× PCR buffer for KOD FX 10µL、2 mmol/L dNTPs 4µL、DNA 模板2µL、10 µmol/L 正 反 向 引 物 各0.6 µL、KOD FX 0.4µL 以及ddH2O 2.4 µL。反应程序：94 ℃2 min；
98 ℃10 s，46 ℃30 s，68 ℃2 min 30 s，35 个循环；
68 ℃5 min。采用琼脂糖凝胶电泳检测预期大小的扩增条带，将目的条带切下，经TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（Code No.9762）回收后，与TaKaRa pMD19-T 载体连接，连接产物转化TaKaRa DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（Amp）的固体LB 培养基上，37 ℃倒置培养15 h 左右。PCR 筛选阳性克隆，将阳性菌落重新挑入600 µL 含Amp 的LB 液 体 培 养 基 中，37 ℃200 r/min 摇菌6～8 h 后，将菌液送往河南尚亚生物技术公司测序。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.4CtCHS基因序列的结构及生物信息学分析

将克隆获得的CtCHS的cDNA 序列和gDNA 序列分别提交GSDS 2.0 进行基因结构分析，将cDNA 序列提交NCBI ORF Finder 查找最大开放阅读框并获得对应的氨基酸序列。运用表2 中的在线网站对CtCHS基因的内含子及编码蛋白质的氨基酸序列进行生物信息学分析。通过NCBI 数据库中的BlastP搜索CtCHS 同源的氨基酸序列及一些药用植物的CHS 氨基酸序列，并使用MEGA 5.05 软件采用Neighbor-joining 法构建CtCHS 蛋白的系统进化树，通过Bootstrap 方法对进化树进行检测，将Bootstrap值设置为1 000。

表2 分子生物学网站及分析内容Tab.2 Molecular biology websites and application

1.2.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 通过qRTPCR 检测CtCHS基因在红花不同组织、不同发育时期的花及激素胁迫后的表达情况，使用Primer Premier 5 软件设计定量引物（表1），内参基因Ct60S引物序列参考文献[27]。qRT-PCR 采用仪器BIORAD CFX Connect Real-Time System 进行，试剂使用TaKaRa TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）。反应体系10 µL：5 µL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）、1.5 µL cDNA、10µmol/L 正 反 向 引 物 各0.4 µL、2.7 µL RNase free ddH2O。首先将相同组分混匀配成混合液，之后分别加入不同体系中，以保证反应条件的一致性，再加入差异组分。反应程序：95 ℃30 s；
95 ℃5 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，45 个循环。通过仪器自带的熔解曲线程序分析监测PCR 扩增的特异性。每个qRT-PCR 反应重复3 次。数据通过2-ΔΔCT相对定量法对基因进行表达水平分析，运用Excel 2007 采用TTEST法对表达量差异进行显著性分析。

2.1 CtCHS基因cDNA和gDNA的克隆及结构分析

以不同花色红花转录组测序获得的Unigene 基因序列Uni8569 为参考序列设计引物CtCHS-F/R（表1），分别以红色红花花瓣总RNA 反转录合成的cDNA 及gDNA 为模板进行PCR 扩增，获得了1 000、2 000 bp 左右的条带（图1）。将目的条带切胶回收后，分别连接载体pMD19-T，并转化DH5α 感受态细胞。随机挑选单菌落，经PCR 筛选鉴定后，将阳性菌液送往河南尚亚生物技术公司测序。

图1 CtCHS基因的cDNA及gDNA扩增结果Fig.1 PCR amplification result of CtCHS cDNA and gDNA

将测序后的cDNA 和gDNA 序列分别用MEGA 5.05软件与原始序列比对发现，引物CtCHSF/R 扩 增 得 到 的cDNA 全 长1 317 bp，gDNA 全 长1 815 bp。将测序后的cDNA 和gDNA 序列分别提交GSDS 2.0 后发现，红花CtCHS基因含有2 个外显子、1 个内含子（图2）。外显子1 位于25—220 bp，长196 bp，编码第1—66 位氨基酸；
外显子2 位于719—1 728 bp，长1 010 bp，编码第66—401 位氨基酸；
内含子位于221—718 bp，长498 bp，在氨基酸序列Cys66密码子的第1、2碱基。

图2 CtCHS基因结构示意Fig.2 Gene structure diagram of CtCHS

2.2 CtCHS基因的内含子分析

基因序列分析结果表明，CtCHS的外显子和内含子的剪切符合GT-AG 剪切法则[28]，且CtCHS的5′端剪切供体序列是GCATGTgtatgt，3′剪切受体序列为tttcagGTGATA（大写表示外显子序列，小写表示内含子序列），说明其内含子剪接机制较为保守。此外，CtCHS内含子中碱基A 数目为161，碱基T 为186，AT 含量为69.68%，GC 含量为30.32%，AT 含量明显高于GC 含量，且明显高于外显子中AT 含量（39.8%），这与非编码区AT 含量高的特点是一致的。

使用Plant CARE 分析内含子序列后发现，CtCHS基因的内含子含有多个真核生物启动子响应元件TATA-box 和增强子元件CAAT-box，可能在增强基因转录中发挥作用。另外，内含子序列中还有富含AT 的DNA 结合蛋白（ATBP-1）的结合位点AT-rich element、光响应元件的一部分TCT-motif、光响应元件GT1-motif、光响应模块的部分元件AEbox、参与光响应的MYB 结合位点MRE、干旱胁迫响应元件MBS（表3），说明CtCHS内含子可能参与了该基因的转录反应，并可能受光照、干旱等的诱导。

表3 CtCHS基因内含子中的特异顺式作用元件Tab.3 Specific cis-acting elements in intron of CtCHS gene

2.3 CtCHS基因编码蛋白质的生物信息学分析

使用NCBI ORF Finder 查找后发现，所克隆的CtCHS基因的1 317 bp cDNA 序列中含有1 个1 206 bp 的最大开放阅读框（25—1 230 bp），起始密码子ATG，终止密码子TAG，编码401个氨基酸。在其氨基酸序列中能找到CHS高度保守的特征性多肽序列RLMMYQQGCFAGGTVLR 和GVLFGFGPGL[14]。通过NCBI CD-search 分析CtCHS 氨基酸序列的保守结构域发现，CtCHS 含有3 个活性位点C170、H309、N342，这3个活性位点构成了查尔酮合成酶典型的三联催化中心C-H-N（图3A）。此外，CtCHS还含有8个丙二酰辅酶A结合位点K61/R64/M65/F221/F271/312G/313P/314A，15 个产物的结合位点和30个双聚体组合的接合面。植物CHS蛋白家族常见的保守域CHS_like、Chal_sti_synt_N、PLN03170、BH0617等在CtCHS蛋白的保守域分析中也都能找到。

蛋白质氨基酸的亲疏水性主要由其侧链基团R决定，如果R仅为H或是C、H 2个元素组成，均是疏水的，如果含有极性侧链基团，如-OH、-SH、-COOH、-NH2等，则是亲水的。根据ExPASy-Prot Scale 在线工具的Hphob./Kyte&Doolittle 算法对CtCHS 蛋白的亲水/疏水性进行分析，结果如图3B 所示。从整体来看，亲水氨基酸（负值）稍多于疏水氨基酸（正值），表明CtCHS 蛋白为亲水性蛋白，且第360 位丙氨酸（Ala，A）分值最低（-2.644），亲水性最强，第348 位缬氨酸（Val，V）分值最高（2.422），疏水性最强。另外，采用ExPASy-ProtParam 分析CtCHS 蛋白的总平均亲水性（GRAVY），其值为-0.069，这与上述结论是一致的。

信号肽是引导蛋白质跨膜转移的一段疏水性氨基酸，负责把蛋白质引导到含不同膜结构的亚细胞器内。经SignalP 4.0 Server 在线软件分析发现，CtCHS 蛋白平均信号肽分值Mean S 为0.125，低于0.5，表明CtCHS 蛋白不存在信号肽（图3C），可能在合成处起作用，不存在转运。

图3 CtCHS编码蛋白质的生物信息学分析Fig.3 Bioinformatic analysis of the protein encoded by CtCHS

蛋白质跨膜结构分析有助于蛋白质功能的初步分析，如某蛋白质没有跨膜结构，但是亚细胞定位显示其可定位于膜相关结构，则说明该蛋白质可能是通过其他膜定位蛋白质招募过去的。另外，蛋白质的跨膜结构分析也和蛋白质的亚细胞定位预测密切相关，而基因定位于哪个亚细胞结构，与其功能是密切相关的。使用TMHMM Server V.2.0 在线分析软件对CtCHS 蛋白进行跨膜结构分析发现，CtCHS 蛋白不存在跨膜结构，可能定位于与膜无关的结构。进一步的亚细胞定位分析发现，CtCHS 蛋白定位于细胞质（表4）。

表4 CtCHS亚细胞定位预测结果Tab.4 Subcellular localization prediction results of CtCHS

2.4 CtCHS蛋白的系统进化分析

在NCBI 数据库中搜索已报道的一些药用植物CHS 的氨基酸序列，构建邻接法系统进化树，分析药用植物CHS 的进化关系。结果（图4）显示，CtCHS 与已报道的 红花CtCHS2（BAV37882.1）有99%的同源性，而与CtCHS4（ATZ81753.1）、CtCHS3（BAV37883.1）进化关系较远，表明CtCHS 家族成员存在不同的进化。另外，CtCHS 与同为菊科的矢车菊CHS 首先聚为一支，表明进化关系最近，其次与菊科大蓟、黄花蒿聚为一个大分支，表明进化关系也较近，而与兰科白芨和铁皮石斛、鸢尾科香雪兰、唇形科黄芩等的进化关系较远。进化分析结果还表明，同科不同种的CHS 进化关系较近，比如同为菊科的紫茎泽兰、CtCHS1、金龙胆草、菊花聚成一个大分支，而同为蓼科的苦荞、虎杖，同为豆科的甘草、膜荚黄芪等各自聚为一个小分支，表明药用植物CHS蛋白具有明显的种属特性。

图4 CtCHS蛋白与药用植物CHS蛋白的系统进化分析Fig.4 Phylogenetic tree of CtCHS and CHS in pharmaceutical plants

2.5 CtCHS基因的组织特异性表达分析

利用qRT-PCR检测不同红花不同组织（初期果球、苞片、幼根、幼茎、幼叶）及不同发育时期花中CtCHS基因的表达量。结果（图5）表明，不同品种CtCHS基因均是在花中表达量最高，在初期果球和幼根中的表达量最低。不同发育时期花中，红色和白色红花中，CtCHS基因的表达量呈现相同的表达趋势，且均是在S6 期表达量最高，其次是S2，但不同的是红色红花中CtCHS在S3期表达量最低，而白色红花在S4期表达量最低。另外，红色和白色红花中CtCHS基因的表达量在花发育的S1、S3期及幼茎和幼叶中差异显著（P<0.05），在花发育的S5期差异极显著（P<0.01），而在其他时期、其他组织中差异不显著。

图5 不同品种红花中CtCHS基因的组织表达模式分析Fig.5 Tissue expression analysis of CtCHS gene in different varieties of Carthamus tinctorius L.

2.6 CtCHS基因在不同激素处理下的表达模式分析

qRT-PCR 检测结果表明，茉莉酸甲酯处理3 h后，CtCHS基因的表达受到诱导，表达量最高，但在处理12、24 h 后表达量变化不明显（图6A）。另外，qRT-PCR 检测表明，该基因的表达受赤霉素、脱落酸、生长素的强烈抑制（图6B、6C、6D）。其中，赤霉素和生长素处理24 h 后抑制效果最显著；
而脱落酸在处理后的3 h 表达量最低，处理6 h 后表达量上升，之后表达量又下降。

图6 CtCHS在不同激素处理下的表达分析Fig.6 Relative expression analysis of CtCHS under different hormone stresses

内含子是真核生物中的一段特殊DNA序列，无编码功能，在mRNA 加工过程中被剪切掉，最终不存在于成熟RNA 分子中[25]。通常认为内含子不具有基因功能，是冗余的DNA 序列，然而近年来越来越多的研究表明，内含子含有类似增强子等的顺式作用元件，可以增强基因表达，在基因转录、表达调控及基因演变过程中有重要作用[30]。另外，内含子的选择性剪接，可以使一个基因在不同组织细胞中、不同发育阶段产生特定功能的蛋白质，以满足机体代谢的需要[28]。本研究在CtCHS基因的内含子中发现了TATA 及CAAT 等真核生物启动子响应元件、TCT 及GT1 等光响应元件、MBS 等逆境应答元件，表明CtCHS基因内含子可能具有增强该基因转录的作用，并可能受光照、干旱胁迫诱导，但具体的功能还需要进一步的研究证实。

不同植物中的CHS基因大多含有2个外显子和1个内含子，且第1个外显子编码30～60个或更多氨基酸，第2 个外显子编码340 多个氨基酸[14]，仅有少数例外，如从白芨中克隆获得的CHS基因没有内含子[18]，金鱼草CHS含有2 个内含子[31]。本研究克隆所得的基因含有2个外显子和1个内含子，外显子1编码第1—66位氨基酸，外显子2编码第66—401位氨基酸，这与上述结论是一致的，且与大多数已报道的植物CHS基因的结构也是相似的[32⁃33]。此外，不同植物CHS基因中内含子的位置大致相同，介于第60 位左右Cys 密码子的第1、2 碱基，但是内含子长度从50 bp 至几个kb 不等[14]。本研究所获得的基因 的 内 含 子 在gDNA 序 列 的221—718 bp，长498 bp，推导其介于氨基酸序列的Cys66 密码子的第1、2碱基，与上述研究结果一致。

生物信息学分析结果表明，CtCHS 蛋白的总平均亲水性（GRAVY）值为-0.069，且亲水氨基酸（负值）稍多于疏水氨基酸（正值），表明CtCHS 为亲水性蛋白，这和铁皮石斛、艾纳香及藤茶CHS 蛋白的性质一样[15⁃16，33]，而与张太奎等[34]报道的金花茶等10种观赏植物CHS基因编码的蛋白质可能为稳定的疏水性蛋白的观点不一致。另外，生物信息学分析还发现，CtCHS 不存在信号肽，无跨膜结构，定位于细胞质，这些和大多数报道的CHS基因的结构也是一致的[15，32]。这也表明大多数植物中的查尔酮合成酶均是在细胞质中的核糖体上合成后直接发挥作用，不经转运。

但也有少数例外，比如SASLOWSKY 等[35]的研究表明，拟南芥CHS 蛋白定位于细胞核、内质网和液泡膜；
TIAN 等[36]对葡萄发育过程中CHS 的定位研究表明，CHS 蛋白定位于内质网和表皮细胞的细胞质中；
甘蔗的7 个CHS基因有不同的定位分布[22]。

本研究中，经组织特异性表达分析发现，CtCHS基因在花中的表达量高于其他组织，而在初期果球和幼根中的表达量最低。桑树中的5个CHS基因表现出不同的组织表达模式，MaCHS1/MaCHS2在果实中表达量较高，MaCHS4在根皮、茎皮和老叶中表达显著，而MaCHS3和MaCHS5在老叶中表达量最高[37]。表明CHS 超基因家族不同成员的表达模式不尽相同。另外，刘秀明等[25]的研究发现，CtCHS1在吉红油姊妹系的盛花期和衰落期表达量最高，而在吉红一号的花蕾期和盛花期的表达量最高，推测品种的差异性也可能导致CHS基因的表达量不同。本研究发现，红色红花中CtCHS在S3 期表达量最低，白色红花在S4 期表达量最低，且红色和白色红花中CtCHS基因的表达量在花发育的S1、S3时期及幼茎和幼叶中差异显著，在花发育的S5时期差异极显著，这与上述观点一致。另外，研究发现，白芨BsCHS在花和茎中表达较强，叶和根部次之，嫩蒴果最低[18]；
藤茶中AgCHS1在成熟叶和花中的表达量最高，在老叶中的表达量最低[33]；
菊芋HtCHS在根中表达量最高，其次是块茎、茎和叶片[32]；
向日葵HaCHS在花中表达量最高，其次是盘、叶、茎和种子，在根中的表达量最低[38]。表明CHS的表达受发育阶段和环境因子的影响，在不同植物、不同组织部位及不同时期的表达量不同。

本研究中，CtCHS受茉莉酸甲酯的诱导不明显，与CtCHS4响应茉莉酸甲酯诱导促进了红花醌式查尔酮类化合物的积累[26]的研究结果有些差异，这可能是品种间的差异造成的。薛英茹[39]研究发现，CtCHS基因响应茉莉酸甲酯诱导的模式因品种不同而不同，同一个CHS基因在茉莉酸甲酯处理云南巍山红花后表达量明显升高，而处理新红花7号后，该基因的表达量则有所降低，特别在诱导后的6、12 h降低最明显。薛英茹[39]还发现，CtCHS3720、CtCHS1515和CtCHS533基因对红花黄酮类生物合成途径的贡献因品种不同而不同，可能参与了红花不同化学型品系黄酮类化合物的形成过程。另外，研究也表明，CHS 超基因家族虽然在氨基酸水平上表现出高度的相似性，但在进化过程中可能存在冗余或不同的功能，因此对激素的响应也是不同的，比如5 个MaCHS基因在不同胁迫处理后表现出不同的响应模式[37]。而本研究中CtCHS受赤霉素、生长素、脱落酸的强烈抑制，和苦蘵PaCHS1及向日葵HaCHS上的研究结果是相似的[23，38]。