薏苡叶斑病病原菌分离及其拮抗内生细菌的筛选

普凤雅，何开潇，叶建萍，和庆康，谷书杰，何永宏，杨志清，，3*

（1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；
2.云南农业大学 云南省药用植物生物学重点实验室，云南 昆明 650201；
3.云南农业大学 西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南 昆明 650201）

薏苡（Coix lacryma-jobiL.）属于禾本科（Gramineae）玉蜀黍族（Maydeae）薏苡属（CoixL.）植物，为《中国药典》2020年版收载品种。薏苡被认为是药食兼备的珍贵良药，其成分具有较高的营养价值和独特的药用价值，享有“禾谷类保健滋补之王”的美誉［1］。近年来，云南省薏苡的种植面积逐渐扩大，薏苡产业迅速崛起，成为农民增收致富的支柱型产业。但因为长期以传统的方式栽培，粗放管理，薏苡的病虫害日益加重［2］。在薏苡的整个生长发育期间，主要病害有黑穗病、叶斑病、叶枯病，其中薏苡叶斑病主要是在下部老叶先出现病斑，逐步向上部嫩叶蔓延，主要危害植株叶部，造成叶片黄枯，最终导致薏苡产量减少、品质下降［3］。目前，主要是利用化学药剂对薏苡叶斑病进行防治［4］，但长期使用化学杀菌剂容易使病原菌产生抗性而导致防治效果降低，也会有大量农药残留，危害生态环境，威胁人类的健康，还会导致“3R”问题［5］。目前对农作物病虫害的防治，人们提出了很多措施，其中通过筛选植物内生菌中的生防菌进行生物防治是当前研究的热点［6］，例如：苑宝洁等［7］筛选出的解淀粉芽孢杆菌ZF57微粉剂对黄瓜棒孢叶斑病的田间防治效果高达97.12%；
冶福春等［8］从燕麦生境中分离获得的1株生防菌株Qh-618对燕麦叶斑病的防治效果达65%以上；
甘金佳等［9］研究了用枯草芽孢杆菌防治番茄灰霉病、青枯病、早疫病、立枯病、枯萎病和根腐病；
王建鹏等［10］通过平板对峙法筛选出3株芽孢杆菌C-01、C-02、C-05，它们对藜麦叶斑病的抑菌率分别为45.00%、49.33%、48.33%。

生物防治是有效又绿色环保的防治方法，能在有效提升农业病虫害防治效果的基础上推动我国绿色农业的可持续发展［11］。但在对薏苡叶斑病的防治研究中，有关生物防治的文献仍少见。本研究对具有典型薏苡叶斑病病斑的师薏1号带病植株进行分离鉴定，通过平板对峙法筛选出对薏苡叶斑病有生防效果的菌株，并对其进行了鉴定，旨在为进一步探索薏苡叶斑病病原菌的分类筛选、生物学特性及微生物防治提供依据。

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验于2020年9月—2021年12月在云南省高校作物种质创新与可持续利用重点实验室进行。供试感病植株取自云南曲靖市师宗县（师薏1号）。供试薏苡内生细菌由本课题组从薏苡（文薏2号）的根、茎、叶中分离保存。

供试病原菌：玉米大斑病原真菌大斑凸脐蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、玉米小斑病原真菌玉蜀黍离蠕孢（Bipolaris maydis）、禾谷茎腐病原真菌禾谷镰孢（Fusarium graminearum）、烟草炭疽病原真菌胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米纹枯病原真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）均由云南农业大学植物保护学院生物防治实验室提供；
甘蔗梢腐病原真菌串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）由云南农业大学甘蔗研究所提供。

1.1.2 培养基 LB培养基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1000 mL；
固体培养基在此基础上加入琼脂17 g；
均在121 ℃下灭菌20 min。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL；
固体培养基在此基础上加入琼脂17 g；
均在115 ℃下高压灭菌20 min。

1.2 薏苡叶斑病的分离鉴定

1.2.1 病原菌的分离纯化 采用组织块分离法［12］，选取薏苡的感病叶片，从病健交界处切取4～5 mm的感病组织，放入75%的酒精溶液中消毒，浸泡约1 min后使用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干，接入PDA培养基中，在25 ℃的培养箱中培养3～4 d。待PDA平板上长出疑似病原菌的微菌落后，用无菌接种针挑取菌落边缘的菌丝块，在新鲜的PDA平板上纯化培养。

1.2.2 病原菌致病性的检测 利用柯赫氏法［13］对分离物进行致病性测定。

离体叶片培养：将分离物在PDA培养基上预培养5 d后，选取健康的薏苡叶片，表面用75%的酒精消毒，然后用无菌针在叶片表面刺伤形成伤口，将上述分离纯化的分离物打成菌饼倒贴于刺伤处，重复3次。接种后保湿，在28 ℃下培养，待叶片发病后，从病部对病原菌进行再分离，观察所分离物的形态特征与原分离物的是否一致。

盆栽喷施：将病原菌培养至产孢状态，利用无菌水配制成一定浓度的孢子悬浮液；
将孢子悬浮液喷施在薏苡叶片上，观察植株是否发病；
待叶片发病后，从病部对病原菌进行再分离，观察所分离物的形态特征与原分离物的是否一致。

1.2.3 病原菌的鉴定 将纯化的病原菌菌株在PDA培养基上培养，观察菌株的菌落形态、颜色和产孢情况。参照OMEGA真菌DNA小量提取说明书进行病原菌基因组DNA的提取，利用ITS通用引物进行PCR扩增，将目的片段送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3 生防菌的筛选

1.3.1 生防菌的初筛 使用平板对峙培养法［14］，用打孔器将病原菌丝块处理成直径为0.50 cm的菌饼，将菌饼接种到直径为9.00 cm的PDA板的中心，在离中心3.00 cm的四周，接种不同的薏苡内生细菌。以接种无菌水作为对照，每个处理3次重复，在28.0 ℃的细菌培养箱中培养3 d后，测量抑菌带的大小。

1.3.2 生防菌的复筛 在初筛中，将抑菌带平均宽度大于1.50 cm的内生细菌作为复筛菌株。将复筛菌株的菌丝块处理成直径为0.50 cm的菌饼，然后将菌饼接种于PDA培养基中心，在离中心3.00 cm的四周，接种其拮抗的薏苡内生细菌。以接种无菌水作为对照，每个处理3次重复；
3 d后测量抑菌圈大小，并计算抑菌率。

1.3.3 生防菌的广谱性测定 对抑菌率最高的内生菌进行广谱性测定，方法与1.3.2节中的方法相同。

1.4 生防菌的鉴定

将生防效果最好的菌株在LB培养基上划线，在35 ℃下培养24 h后，对菌株进行形态学观察。使用通用引物27F：AGTTTGATCMTGGCT和1492R：GGTTACCTTGTTACGACT，以及持家基因gyrA的引物GyrA-F（5′-CAGTCAGGAAATGCGT ACGTCCTT-3′）和GyrA-R （5′-CAAGGTAATGCT CCAGGCATTGCT-3′）进行PCR扩增。将目的片段送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

2.1 病原菌的分离与致病性检测

如图1a所示，将病原菌菌饼放在健康的薏苡叶片上，在28 ℃下培养3 d后，发现薏苡叶片变黄，表面有斑点，而对照则无症状。通过组织块分离法分离后，在PDA培养基上纯培养物的形态特征与先前分离得到的Y2一样，镜检观察到的分生孢子也与Y2一致，说明菌株Y2可能引起离体的薏苡叶片发病。为了进一步验证，将Y2菌株配制成孢子悬浮液，并喷施在薏苡叶片上，结果如图1b所示，在喷施10 d后，薏苡叶片枯萎，有感病现象;再分离物的形态特征和孢子结构也均与Y2一致，符合科赫式法则，表明Y2病原菌对薏苡叶片有致病作用。

图1 薏苡叶斑病分离病菌的致病性检测结果

2.2 病原菌的鉴定

2.2.1 形态观察 如图2所示，分离得到的Y2病原菌的菌落为圆形，菌落灰褐色，绒毛状，不易产孢，背面呈淡棕色；
分生孢子单生，有隔膜，卵形，屈膝状弯曲。

图2 薏苡叶斑病病原菌的形态特征

2.2.2 ITS序列鉴定 用真菌的通用引物ITS1/ITS4对Y2进行PCR扩增，将扩增结果提交给Gen Bank，与序列相似性较高的模式菌株进行比对，构建系统发育树，结果如图3所示，分离得到的Y2菌株与Curvularia coicis（登录号：NR_147457.1）在同一个分支上，相似度达89%，因此将Y2鉴定为弯孢霉Curvularia coicis。

图3 基于ITS序列的系统发育树

2.3 生防菌的筛选

2.3.1 生防菌的初筛 由表1可知：共筛选到12株对薏苡叶斑病病原菌有抑制作用的薏苡内生细菌，抑菌带均大于1.00 cm；
其中菌株R24、L21、R26、L47的抑菌带均在1.50 cm以上，以L47的抑菌效果最好，抑菌带达1.76 cm。

表1 内生细菌菌株与薏苡叶斑病菌平板对峙培养结果

2.3.2 生防菌的复筛 对初筛中抑菌带在1.50 cm以上的4株内生细菌菌株进行复筛，结果如表2和图4所示，4株细菌的抑菌率在65%以上；
其中分离自文薏2号茎秆的L47的抑菌率最高，为73.82%；
分离自文薏2号根系的R24的抑菌率最低，只有66.23%。

图4 生防菌的复筛结果

表2 生防内生细菌菌株的复筛结果

2.3.3 生防菌L47的抑菌广谱性测定 经过初筛和复筛，发现分离自文薏2号茎秆的L47菌株的生防效果最好。采用平板对峙法对L47菌株进行抑菌谱的测定，结果如表3和图5所示，菌株L47对玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷茎腐病菌、烟草炭疽病菌等都有抑制作用，抑菌率在64%～73%之间。

图5 L47对几种病原真菌的抑制作用

表3 菌株L47的抑菌广谱性测定结果

2.4 生防菌的鉴定

生防菌L47的菌落形态如图4和图6所示，菌落圆形，白色，表面粗糙。对菌株L47进行16S rDNA基因片段扩增，将PCR扩增产物结果提交给Gen Bank，与序列相似性较高的模式菌株进行比对，构建系统发育树（图7）。结果显示：菌株L47与Bacillus subtilis（登录号：NR 027552.1：34-989）在同一个分支上（图7a），相似度达96%，为枯草芽孢杆菌。将gyrA基因序列的测序结果在NCBI中进行BLAST比对，结果显示菌株L47与Bacillussp.（登录号：OK564471.1：1-921）的gyrA基因序列最为相似，同源性达94%（图7b）。

图6 生防菌L47的菌落形态

图7 菌株L47的系统发育树

薏苡叶斑病发病初期在叶片上出现水渍状半透明小斑点，周边为淡黄色晕圈，随后在水渍状斑点中心出现1个白色小点；
之后病斑继续扩大，到拔节期会大面积发病，导致叶片枯萎，植株生长减弱，产量和品质下降［15］。章霜红［16］将薏苡叶斑病的病原菌鉴定为尾孢（Cercosporasp.）。在本研究中，将感病叶片在PDA培养基上培养，再将培养物分离纯化、进行致病性检测后，发现纯化培养物能够使薏苡叶片发病；
再分离感病植株得到的纯化物与Y2的形态特征、孢子形态一致；
通过ITS序列扩增，将其鉴定为Curvularia coicis［17］。这与Dai等［18］从福建薏苡叶斑病病叶上分离纯化得到的病原菌一样。

生物防治具有无污染、不会诱发抗药性的优点，弥补了化学防治的诸多不足［19］。枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害已成为国内外研究的热点［20－21］。枯草芽孢杆菌通过成功定殖在植物体内，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的［22－23］。

本研究从已经分离得到的薏苡内生细菌中筛选到1株生防细菌L47，L47对薏苡叶斑病病原菌的抑菌率为73.82%，低于谢林艳等［24］筛选的YC89对镰孢炭疽菌的抑菌率，但高于程萍等［25］筛选的B10b对石斛兰叶斑病菌的抑菌率。通过平板对峙法测定生防菌的抑菌广谱性发现，L47具有较宽的抑菌谱，对玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷茎腐病菌、烟草炭疽病菌等菌的生长都有一定的抑制作用，抑菌率为64.29%～73.68%。利用16S rDNA序列进行测序分析，发现菌株L47与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性达到96%；
结合gyrA序列分析，最终将菌株L47鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

目前生防菌的研究大部分集中在实验室内，而有些生防菌株在室内培养皿上和田间农作物上的防治效果大不相同，因此想要得到生防能力高效且稳定的菌株，需要将培养皿筛选、盆栽生防效果以及田间生防效果相结合。此外，还需要对菌株的生防机理、生长环境以及基因型进行研究，从而为生物防治奠定理论基础。

本研究筛选得到1株对薏苡叶斑病有防治效果的内生细菌L47；
发现L47对玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷茎腐病菌、烟草炭疽病菌等均有一定的抑制效果；
将菌株L47鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。