H型高血压患者MTHFR基因C677T位点多态性检测的临床价值

王 珊， 徐旻一， 王 微， 蒋明明， 卢 培， 熊仲波， 王 蕾

（1.汶上县人民医院检验科，山东 济宁 272500；
2.上海市第八人民医院 上海市第六人民医院徐汇分院检验科，上海 200235）

高血压伴高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症是缺血性心血管事件和脑卒中事件的主要诱发因素[1]。临床将Hcy>10 μmol/L的高血压定义为H型高血压[2]。目前，我国高血压患者中H型高血压所占比例呈逐年升高趋势[3]，因此监测Hcy水平对高血压患者具有重要意义。Hcy水平升高的原因主要为摄入增加和代谢障碍。叶酸是能有效降低Hcy水平的药物之一[4]。叶酸必须通过亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）转化为5-甲基四氢叶酸，为Hcy代谢提供甲基供体[5]。MTHFR基因遗传缺陷或变异会影响叶酸活化，进而造成Hcy代谢受阻，导致Hcy水平升高[6]。C677T突变是MTHFR基因最常见的突变位点，可导致MTHFR活性显著降低[7]。MTHFR基因C677T位点多态性在不同种族、不同地域之间存在明显差异，欧洲人群C677T突变率为22%～44%，日本人群约为34%，我国汉族人群约为50%[8]。本研究旨在分析MTHFR基因C677T位点多态性与Hcy水平的关系，以及C677T位点多态性对H型高血压叶酸治疗的影响，为H型高血压个性化治疗提供实验室依据。

1.1 研究对象

选取2018年4月—2019年3月上海市第八人民医院收治的高血压患者215例，其中男126例、女89例，年龄36～80岁。入选标准：（1）高血压依据《中国高血压防治指南2010》[9]中的诊断标准确诊；
（2）近3个月内未服用叶酸或B族维生素；
（3）无肿瘤及心、肝、肾、脑等器官的严重疾病；
（4）女性未处于妊娠期或哺乳期。根据患者血清Hcy水平，将血清Hcy>10 μmol/L的患者归入H型高血压组（143例），将血清Hcy≤10 μmol/L的患者归入非H型高血压组（72例）。根据《中国高血压防治指南2010》[9]中的分级标准，将215例高血压患者分为Ⅰ级高血压组[收缩压为18.6～21.1 kPa和/或舒张压为12.0～13.2 kPa]（48例）、Ⅱ级高血压组[收缩压为21.3～23.8 kPa和/或舒张压为13.3～14.5 kPa]（77例）、Ⅲ级高血压组[收缩压≥23.9 kPa和/或舒张压≥14.6 kPa]（90例）。另选取上海市第八人民医院健康体检者113名作为正常对照组，其中男63名、女50名，年龄40～77岁。纳入标准：无冠心病、糖尿病、高血压病史，肝、肾功能均正常。各组间年龄、性别及高血压病程等一般资料差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究经上海市第八人民医院伦理委员会批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采集所有对象清晨空腹10 h的静脉血5 mL，其中3 mL置于促凝管中，2 000×g离心10 min，分离血清，用于检测Hcy；
另2 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用于检测MTHFR基因C677T位点多态性。

1.2.2 血清Hcy水平测定 采用循环酶法检测Hcy，试剂盒购自英国Axis-Shield公司，检测仪器为AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.2.3 MTHFR基因C677T位点多态性测定 采用氯化铵裂解法提取外周血白细胞，置于PHARM-GENESNP分析样品保存液（北京华夏时代基因科技发展有限公司）中，4 ℃保存备用。以PHARM-GENE200 SNP分析样品处理液（北京华夏时代基因科技发展有限公司）为基因探针，采用数字荧光分子杂交法检测MTHFR基因C677T位点多态性。检测仪器为TL998A基因扩增荧光检测仪（西安天隆科技有限公司）。

1.2.4 叶酸治疗后的血清Hcy测定 对H型高血压患者给予口服马来酸依那普利叶酸片（每片含马来酸依那普利10 mg、叶酸0.8 mg，深圳奥萨医药有限公司），1片/次，每日2次，连续服用6个月，测定患者口服叶酸6个月后血清Hcy水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用基因频率法计算等位基因频率，采用拟合优度χ2检验进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。呈非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 MTHFR基因C677T位点多态性分析

Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果显示，所有对象的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（χ2=1.07，P>0.05），具有群体代表性。

2.2 H型高血压组、非H型高血压组及正常对照组血清Hcy水平比较

H型高血压组血清H c y水平为2 1.3（16.3～27.5）μmol/L，显著高于非H型高血压组[8.2（4.7～9.6）μmol/L]和正常对照组[8.4（4.2～15.7）μmol/L]（P<0.01）。非H型高血压组与正常对照组血清Hcy水平差异无统计学意义（P>0.05）。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级高血压患者血清Hcy水平分别为16.9（12.1～25.8）、20.1（15.1～28.1）和26.8（21.3～30.7）μmol/L。Ⅲ级高血压组血清Hcy水平显著高于Ⅰ级高血压组和Ⅱ级高血压组（P<0.05）。Ⅰ级高血压组、Ⅱ级高血压组之间血清Hcy水平差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 H型高血压组、非H型高血压组和正常对照组MTHFR C677T位点基因型分布和等位基因频率比较

215例高血压患者中，CC基因型65例（30.2%）、CT基因型100例（46.5%）、TT基因型50例（23.3%）。H型高血压组CC、TT基因型频率及C、T等位基因频率与非H型高血压组、正常对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。H型高血压组CT基因型所占比例最高，CC基因型所占比例最低。正常对照组TT基因型所占比例最低，CC基因型所占比例最高。见表1。

表1 H型高血压组、非H型高血压组及正常对照组之间MTHFR C677T位点基因型分布和等位基因频率比较

2.4 Ⅰ级高血压组、Ⅱ级高血压组、Ⅲ级高血压组之间MTHFR C677T位点基因型分布和等位基因频率比较

Ⅱ级、Ⅲ级高血压组TT基因型频率及T等位基因频率均显著高于Ⅰ级高血压组（P<0.05）。见表2。

表2 Ⅰ级高血压组、Ⅱ级高血压组、Ⅲ级高血压组之间MTHFR C677T位点基因型分布和等位基因频率比较

2.5 不同基因型H型高血压患者治疗前Hcy水平比较

TT基因型H型高血压患者治疗前血清Hcy水平为26.2（20.4～33.5）μmol/L，显著高于CC基因型患者[17.3（13.5～24.5）μmol/L]和CT基因型患者[18.8（14.9～25.0）μmol/L]（P<0.01）。CC基因型患者与CT基因型患者之间治疗前血清Hcy水平差异无统计学意义（P>0.05）。

2.6 不同基因型H型高血压患者治疗前后血清Hcy水平比较

不同基因型的H型高血压患者采用叶酸治疗后血清Hcy水平均低于治疗前（P<0.05）。TT基因型的H型高血压患者叶酸治疗前、后血清Hcy水平均显著高于CT基因型患者和CC基因型患者（P<0.01）。见表3。

表3 不同基因型H型高血压患者叶酸治疗前、后血清Hcy水平比较

有研究结果显示，高血压和高Hcy血症对促进心脑血管疾病的发生具有协同作用，伴有高Hcy血症的高血压患者发生心脑血管疾病的风险显著高于无高Hcy血症的高血压患者[10]。Hcy水平受环境因素和遗传因素的双重影响，代谢过程中酶功能障碍或维生素缺乏均可导致血浆Hcy升高[7]。增加维生素B6、维生素B12和叶酸的摄入，可以降低血浆Hcy水平，因此叶酸被相关指南[9，11]列为降低Hcy的推荐药物。MTHFR是叶酸代谢途径的关键酶，催化5，10亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，而5-甲基四氢叶酸可作为细胞内的甲基供体，在甲硫氨酸合成酶和维生素B12的催化下，使血液中Hcy发生甲基化，生成甲硫氨酸，从而维持血液中Hcy的水平[12-13]。MTHFR基因C677T位点突变会影响MTHFR的活性，使Hcy代谢发生障碍，从而导致高Hcy血症。

本研究结果显示，H型高血压组MTHFR C677T位点TT基因型（纯合突变）频率明显高于非H型高血压组（P<0.05），提示MTHFR C677T位点TT基因型可能与H型高血压有关。理论上杂合变异（CT基因型）的MTHFR活性只有正常酶活性的65%[7]，然而本研究结果却未提示CT基因型与高Hcy血症之间有关联，这可能是由于Hcy水平升高并非都是由MTHFR基因变异决定的，饮食、环境等因素也会影响Hcy水平。

本研究根据《中国高血压防治指南2010》[9]将高血压患者分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，结果显示，Ⅲ级高血压患者血清Hcy水平显著高于Ⅱ级和Ⅰ级高血压患者（P<0.05）。这提示血清Hcy水平可能与高血压的严重程度相关。本研究结果还显示，Ⅱ、Ⅲ级高血压患者的TT基因型频率明显高于Ⅰ级高血压患者（P<0.05），且Ⅱ、Ⅲ级高血压患者T等位基因频率显著高于Ⅰ级高血压患者（P<0.05），这提示MTHFR基因C677T位点的TT基因型（纯合突变）发生频率可能与高血压的严重程度有一定的关联性。

WANG等[14]发现，C677T位点的纯合突变会导致患者的MTHFR活性显著降低，使叶酸无法有效发挥作用。本研究结果也显示，MTHFR基因C677T位点TT基因型患者叶酸治疗前、后的血清Hcy水平均显著高于CT基因型患者和CC基因型患者（P<0.01）。提示MTHFR基因C677T位点TT基因型（纯合突变）与Hcy水平密切相关，C677T位点基因多态性亦可能与高血压的严重程度有关。另外，高Hcy血症的发生与叶酸缺乏密切相关[15]。本研究结果显示，不同MTHFR基因C677T位点基因型的H型高血压患者采用叶酸治疗后血清Hcy水平均低于治疗前（P<0.05），提示叶酸能有效降低H型高血压患者的Hcy水平；
但TT基因型的H型高血压患者血清Hcy水平虽较治疗前有所下降，却仍处于较高的水平。究其原因，Hcy代谢是多途径、多因素参与的过程，Hcy水平不仅受机体内叶酸水平的影响，还与生活方式、营养因素和遗传因素等有关。MTHFR基因的多态性影响着不同个体对叶酸的需求量。本研究结果有助于临床根据MTHFR基因多态性检测结果对H型高血压患者进行个体化治疗，从而达到最佳疗效。

综上所述，MTHFR基因C677T位点多态性与高血压的严重程度有关。检测MTHFR C677T位点变异对H型高血压个体化治疗疗效评估有较高的临床价值。