Ac-SDKP对矽肺小鼠模型RANKL信号的调节作用*

靳馥宇，王晓菁，李雅倩，李 田，杨欣雨，徐 洪△

(1.华北理工大学公共卫生学院，河北 唐山 063000；
2.华北理工大学基础医学院，河北 唐山 063000)

矽肺病是我国最严重的职业病之一，是长期吸入游离二氧化硅所致的肺部疾病。目前，有研究认为，巨噬细胞吞噬二氧化硅引起肺部炎性反应，最终导致肺纤维化和结节性病变的形成[1]。有研究显示，在尘肺病患者和矽肺马中均发现了骨密度下降和骨质疏松症[2-4]。因此，推测矽肺病和骨质疏松症可能具有共同的信号传导通路，核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)信号是破骨细胞分化的关键信号通路[5]，RANKL通过信号受体RANK传递信号。通过激活破骨细胞生成的活化T细胞核因子1(NFATc1)诱导破骨细胞生成，表达破骨细胞基因[6]。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)是破骨细胞分化的重要标记物之一，且其在慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者的肺组织中均检测出TRAP的阳性表达[7-8]，证实肺部疾病与破骨细胞活化可能具有相同的信号传导通路。N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)是一种体内肾素-血管紧张素系统调节肽，本课题组前期研究证明其具有抑制矽肺大鼠肺纤维化的作用。因此，本研究拟通过体内研究观察RANKL信号在矽肺小鼠模型中是否被激活，且Ac-SDKP能否通过调节RANKL信号发挥拮抗矽肺小鼠的作用及其效果。

1.1材料 二氧化硅(SiO2)粉尘购于美国Sigma公司；
Ac-SDKP购于瑞士Bachem AG公司；
破骨细胞染色试剂盒购于杭州联科生物技术有限公司；
弹力蛋白染色试剂盒购于中国珠海贝索生物技术有限公司；
荧光二抗购于美国Novex公司；
DAPI购于美国Cell Signaling Technology公司；
CD68购于美国Abcam公司；
基质金属蛋白酶-12(MMP-12)购于中国浙江华安生物科技有限公司；
RANKL购于中国台湾Arigo公司；
OC-STAMP购于美国FabGennix公司；
AP-1购于中国台湾Arigo生物公司；
NFATc1购于美国Affinity公司；
NF-κB购于中国台湾Arigo 生物公司；
免疫印迹二抗购于美国KPL公司；
ECL发光试剂购于中国北京庄盟生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1实验性矽肺模型的建立 选取4周龄SPF级雄性C57/BL6小鼠(18只)，平均体重(20±5)g，购于北京维通利华动物技术有限公司[SCXY(京)2016-0008]，饲养于华北理工大学实验动物中心屏障实验室[SYXK(冀)2020-0007]，昼夜交替，自由饮水。经华北理工大学动物伦理委员会批准(LX2019035)。

采用一次性气管灌注SiO2粉尘溶液制备矽肺小鼠模型，每组6只小鼠，实验分组为：(1)对照组，气管灌注50 μL 的0.9%氯化钠溶液饲养4周；
(2)模型组，气管灌注50 μL的 SiO2(50 mg/mL)粉尘溶液饲养4周 ；
(3)Ac-SDKP治疗组，气管灌注50 μL的SiO2(50 mg/mL)粉尘溶液，颈后皮下埋入微量缓释胶囊[含800 μg/(kg·d)]Ac-SDKP饲养4周。造模结束后，小鼠用戊巴比妥麻醉，取出小鼠肺组织，左肺经4%多聚甲醛固定，其余肺组织置于-80 ℃冰箱冻存，固定结束的肺组织经石蜡包埋后切片，做染色处理。

1.2.2TRAP染色 切片脱蜡至水，TRAP染色液覆盖组织，37 ℃孵育过夜，甲基绿复染，自来水冲去多余液体，自然风干，放入二甲苯中，中性树胶封片。选取肺组织中6个视野，采用Image-Pro Plus软件进行阳性细胞数的定量分析。

1.2.3免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，抗原修复后，孵育一抗MMP-12(1∶200)，4 ℃孵育过夜，次日免疫组化二抗37 ℃孵育30 min，苏木精染核，细胞棕染定义为阳性。

1.2.4免疫荧光染色 切片脱蜡至水，抗原修复后，孵育一抗RANKL/CD68(稀释比均为1∶100)，4 ℃孵育过夜，次日用二抗驴抗兔TRITC和驴抗鼠FITC 37 ℃孵育90 min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，镜下观察阳性染色。待扫图后，将切片进行苏木精-伊红染色(HE染色)。

1.2.5弹力蛋白染色 切片脱蜡至水，操作步骤按说明书进行，对切片进行弹力蛋白染色和VG染色，使用Image J软件对图像进行分色处理，使用Image-Pro Plus软件观察并分析弹力纤维和胶原纤维的染色面积。

1.2.6免疫印迹 采用蛋白提取试剂盒提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以每泳道15 μg进行电泳及电转。一抗RANKL、OC-STAMP、AP-1、NFATc1、NF-κB和MMP-12，稀释比为1∶1 000，4 ℃过夜；
二抗(1∶5 000)37 ℃孵育40 min，ECL发光试剂盒显色。采用Image-Pro-plus 6.0图像处理软件对条带进行分析，将吸光度值与α-TUB的吸光度值标准化处理，采用Graphpad8.0进行绘图，横坐标为组别，纵坐标为吸光度比值。

2.1Ac-SDKP对矽肺小鼠弹力蛋白的影响 弹力蛋白染色结果显示，模型组小鼠肺组织弹性纤维表达下调，胶原含量表达上调，Ac-SDKP治疗组中弹性纤维表达上调，胶原含量表达下调，经方差分析，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

图1 Ac-SDKP对小鼠肺组织弹力纤维和胶原沉积的调节作用(20×)

表1 Ac-SDKP对矽肺小鼠肺组织弹力纤维和胶原纤维的影响

2.2免疫组织化学染色结果 与对照组比较，矽肺模型组小鼠肺组织中MMP-12表达增多，Ac-SDKP处理后，小鼠肺组织中MMP-12表达减少。见图2。

图2 免疫组织化学染色结果(40×)

2.3Ac-SDKP对矽肺小鼠肺组织中RANKL信号的影响 免疫荧光结果显示，模型组小鼠肺组织中RANKL和CD68阳性共表达面积增多，且主要定位于矽结节中的巨噬细胞中，而Ac-SDKP治疗组中RANKL和CD68阳性共表达面积减少。见图3。

图3 免疫荧光结果(免疫荧光染色，40×)

2.4TRAP染色结果TRAP染色结果显示，与对照组相比较，模型组小鼠肺组织TRAP阳性细胞染色数目显著上调，而Ac-SDKP治疗组中TRAP阳性细胞染色数目显著下调。见图4、表2。

图4 小鼠肺组织TRAP染色(40×)

表2 Ac-SDKP对矽肺小鼠肺组织TRAP染色的影响

2.5免疫印迹结果 与对照组比较，模型组小鼠肺组织中RANKL信号和MMP-12蛋白表达水平显著上调，而与模型组比较，Ac-SDKP治疗组小鼠RANKL信号和MMP-12蛋白表达水平显著下调。经方差分析，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 AC-SDKP对矽肺小鼠RANKL、OC-STAMP、AP-1、NFATc1、NF-κB和MMP-12蛋白水平的作用

巨噬细胞的融合和多核化在多种慢性炎症疾病中体现为多核巨噬细胞形成和破骨细胞形成，且其来源相同，也遵循着类似的信号传导途径[5]，RANK/RANKL信号是破骨细胞形成的重要信号传导通路，成骨细胞分泌的RANKL与破骨细胞前体细胞膜上的受体RANK相结合，通过其下游转录因子的一系列变化，介导破骨细胞的生成[9]。破骨细胞形成的主要标志为多核巨噬细胞的形成且其呈现TRAP阳性着色[10-11]。目前尚少见关于RANK/RANKL信号的活化在小鼠矽肺模型中的作用，本研究旨在研究矽肺小鼠肺组织中RANKL信号是否被激活的情况。

有文献报道，在过敏性气道炎症小鼠模型中，阻断RANKL信号的传递，可以有效地拮抗小鼠过敏性气道炎症的进展[12]。此外，在类风湿性关节炎-间质性肺疾病[13]和肺癌骨转移[14]模型中，均发现RANKL信号表达上调，提示在肺损伤模型中存在着RANKL信号的激活。也有研究显示，在小鼠肺组织中检出了RANKL mRNA的表达[15]。

本研究结果也显示，模型组矽结节内多核巨细胞和结节周边的单核巨噬细胞中均有TRAP阳性染色。免疫荧光结果显示，RANKL主要定位于矽结节内CD68标记的巨噬细胞中。另外，在模型组中，发现了RANKL信号通路的蛋白水平表达均上调，提示SiO2能够介导小鼠矽肺模型肺组织中RANKL信号的激活。

为了进一步研究RANKL信号在矽肺小鼠模型中的功能和作用，因此检测了MMP-12的表达水平。MMP-12是基质金属蛋白酶家族的成员之一，是由巨噬细胞分泌的一种内切蛋白酶，能够降解弹性蛋白以及其他细胞外基质成分。有研究显示，在肺气肿模型中，抑制MMP-12的活性，可以有效地保护肺组织弹性纤维网[16]，且在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，MMP-12表达上调，导致弹性纤维网破坏，肺泡壁变薄[17]。在急性肺损伤的小鼠模型中，肺组织内MMP-12蛋白表达水平显著上调[18]。在博来霉素所致小鼠肺纤维化模型中，小鼠肺内MMP-12 mRNA的表达和胶原蛋白含量均上调[19]。本研究发现，MMP-12在小鼠矽肺模型中蛋白表达水平上调，弹力蛋白水平降低，同时伴有胶原纤维面积增多。提示SiO2能够介导RANKL信号的活化，并且使巨噬细胞呈现类似破骨细胞的多核化表型及相关酶的表达。

Ac-SDKP是存在于所有哺乳动物体中，是一种通过丙基寡肽酶对胸腺素β4的N端序列作用所产生的具有免疫调节作用的促血管生成肽[20]。在多种纤维化模型中均起到拮抗器官纤维化的作用，如心脏纤维化和肾脏纤维化[21- 22]。本研究结果也显示，Ac-SDKP减少矽肺小鼠肺组织中TRAP阳性表达的多核巨噬细胞和单核巨噬细胞数量；
免疫荧光结果也显示，Ac-SDKP处理后，小鼠肺组织 CD68/RANKL共表达面积减少。

综上所述，即Ac-SDKP能够通过抑制肺组织中巨噬细胞RANKL信号的活化，以拮抗小鼠矽肺纤维化进程。