3D打印多孔β-TCP负载VAN/PLGA缓释微球复合支架的表征评价

王建 范江伟 陈洪涛

感染性骨缺损主要是由于早期不恰当的清创或固定导致伤口裂开，继而引发感染形成的并发症[1]。传统的治疗途径包括植骨、Ilizarov 技术、Masquelet诱导膜技术及抗生素治疗等，虽然有一定的修复效果，但仍难以满足临床治疗。目前最大的难点是缺少一种既具备抗感染能力又能填补骨缺损的骨组织替代材料[2]。随着数字医学技术的发展，3D打印骨组织工程支架负载局部药物缓释系统为治疗感染性骨缺损提供了一种新的途径[3]。

磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)主要是由钙、磷组成，其成分与骨基质的无机成分相似，根据晶体结构的不同可分为高温型α-TCP 和低温型β-TCP[4]。β-TCP具有良好的生物活性和降解性，动物或人体细胞可以在β-TCP材料上正常生长、分化和繁殖，是理想的人体硬组织替代材料[5]。万古霉素(vancomycin，VAN)是糖肽类窄谱抗生素，主要通过干扰细菌细胞壁结构中的关键组分肽聚糖来干扰细胞壁的合成，抑制细胞壁中磷脂和多肽的生成，也可能改变细菌细胞膜的渗透性，对葡萄球菌属中甲氧西林敏感及耐药株有良好的抗菌作用[6-7]。因此将VAN包埋于缓释载体制成缓释微球后进行局部给药，不仅能发挥其抗菌作用，而且还能避免许多不良反应。对于缓释载体的研究，近年来已经有大量的天然或人造材料被广泛应用于缓释微球的制备，天然材料如藻酸盐、胶原、纤维素和明胶，人造材料如聚乳酸、聚乙醇酸及两者的共聚物聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic co glycolic acid，PLGA)[8]。PLGA的降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人代谢途径的副产物，所以当它应用在医药和生物材料中时不会有毒副作用，可以用来充当药物缓释载体[9]。目前，PLGA作为药物缓释载体的制备方法有乳化溶剂挥发法、喷雾干燥法、膜乳化法以及微流体法，乳化溶剂挥发法因简易的操作流程和相对精简的仪器设备成为制备微球最常用的方法[10]。

基于此，本研究通过 3D 打印工艺，以β-TCP为基础材料，构建立体网格状支架。以复乳法制备VAN/PLGA 缓释微球，并用壳聚糖包被静电吸附法将缓释微球负载于3D 打印多孔β-TCP支架，构建既有骨修复作用又有抗菌作用的复合支架，并对支架进行表征评价，观察其缓释性能、力学性能和抗感染修复功能，初步评价其作为修复骨缺损材料的可行性，以期为感染性骨缺损的治疗寻找一种全新的治疗方法。

1.1 实验试剂及仪器

PLGA(购自Sigma公司)；
VAN(购自浙江医药股份有限公司)；
β-TCP(购自上海鼓臣生物技术有限公司)；
壳聚糖、聚乙烯醇(均购自北京有机化学厂)；
二氯甲烷(购自西安化学试剂厂)；
3D喷墨打印机(购自德国Envision TEC公司)；
扫描电镜(购自日本Jeol公司)；
紫外分光光度仪(购自美国HP公司)；
医用离心机(购自北京医用离心机厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 3D打印多孔β-TCP负载VAN/PLGA缓释微球复合支架的构建

(1) 3D打印多孔β-TCP支架：利用CAD软件绘制多孔β-TCP支架，将β-TCP粉与6% PVA黏结剂按5∶3的比例混合为打印墨水，用3D打印机打印，打印完毕后在室温下干燥，并在马弗炉中烧结成质地坚硬的β-TCP骨组织工程支架。

(2) VAN/PLGA缓释微球制备：采用复乳溶剂挥发法(W/O/W)制备缓释微球，将0.3 g/mL的VAN水溶液与44.5 mg/L的PLGA二氯甲烷溶液按1∶9混合后进行超声乳化，形成稳定的乳白色初乳；
并将初乳按1∶4的比例逐滴快速加入2%PVA溶液中，不断搅拌使得有机溶剂快速蒸发，静置后收集沉淀，用纯净水洗涤、离心、真空冻干得缓释微球。

(3) 复合支架构建：将上述制成的β-TCP骨支架用1%冰醋酸溶液配制的2%壳聚糖溶液浸泡，待完全浸湿后取出，放置在 37 ℃烘箱烘干。此操作重复 3 遍，使β-TCP空白支架包被一层带正电荷的壳聚糖，将此壳聚糖包被过的支架放入离心管内，同时滴入带负电荷的 VAN/PLGA 缓释微球蒸馏水悬液，轻微震荡混匀10 min，使微球均匀吸附填充于支架孔隙内，1000 r/min离心5 min，取出材料冻干；
再将此负载有微球的支架浸泡入壳聚糖溶液中，待完全浸湿浸透后，取出冻干即得复合支架。

1.2.2 VAN/PLGA微球β-TCP复合支架的表征评价

(1) 形态学观察：肉眼观察复合支架的形态及大小，在支架表面进行喷金处理后，通过电镜观察其内部结构。

(2) 孔隙率测定：采用置换法测孔隙率。在洁净干燥的比重瓶中装满乙醇，称重为W1，将质量为W0的复合支架浸入乙醇中，超声除气，使得支架孔隙充满乙醇，再向比重瓶中补满乙醇，称重为W2，取出支架，剩余比重瓶称重为W3，测得当前温度下乙醇密度为ρ0。孔隙率 (Φ，% ) =[(W2-W3-W0)/ρ0]/[(W1-W3)/ρ0]×100%。

(3) 载药率、包封率的测定：取2 mg干燥VAN缓释微球置于10 mL试管，加入二氯甲烷1 mL超声振荡溶解，加入PBS液4 mL快速混匀，静置10 min，1000 r/min 离心5 min，取上清采用紫外分光光度仪测量260 nm处吸光度，重复3次取均值，绘制VAN标准曲线，计算微球载药率和包封率。载药率=微球中药物质量/微球总质量；
包封率=微球中药物总质量/投入药物总质量。

(4) 药物缓释率测定：称取一定量的复合支架置于离心管中，加入1 mL二氯甲烷溶解完全，再加入4 mL PBS溶液，离心取上清，测260 nm处吸光度，根据标曲计算复合支架中VAN总含量。再称取等量的缓释微球和复合支架，分别加入5 mL PBS溶液，密封置于 37℃恒温震荡箱中孵育，每间隔2 d收集0.5 mL PBS溶液并用原有PBS补足至原来体积，样品离心后取上清液，测260 nm 处测吸光度，根据标曲计算出药物释放量，每个实验重复3次，平均值用来计算释放率，释放率=药物释放量/支架中总药物量×100%。

(5) 力学性能测定：分别取3个β-TCP空白支架和β-TCP负载VAN/PLGA复合支架，应用万能材料力学试验机比较其力学性能，通过最大负荷和最大强度来衡量性能好坏。

(6) 体外降解实验：配置模拟体液(simulated body fluids,SBF)，分别取β-TCP空白支架和β-TCP负载VAN/PLGA微球复合支架样本，称重后浸入100 m L SBF溶液中，在37 ℃恒温箱中培养。每周换液，并取出样品真空干燥后称重，记录其质量，待复合支架完全降解后，以降解时间为横坐标、质量为纵坐标绘制变化曲线图。

1.3 统计学处理

2.1 形态学

3D打印多孔β-TCP支架外观如图1所示。支架呈白色立方体状(A)，表观体积为6 mm×6 mm×5 mm，在光镜下放大10倍后可见支架表面有许多排列整齐、大小均一的孔隙(B)。

图1 3D打印 β-TCP支架形态

β-TCP负载VAN/PLGA微球复合支架形态学观察见图2。由于3D打印的β-TCP支架外包被了一层带正电荷的壳聚糖，它能与带负电荷的VAN/PLGA微球互相吸附，使得支架表面和内部空隙均匀地覆盖了缓释微球(A)；
取其断面在光学显微镜下放大10倍后就可清楚地看见β-TCP支架上分布着一层大小均匀的圆形颗粒(B)；
将其在扫描电镜下放大300倍后就能看到 β-TCP负载VAN/PLGA微球复合支架的内部形态(B)。

图2 β-TCP负载VAN/PLGA微球复合支架形态学观察

2.2 孔隙率

通过液体置换法测量了β-TCP空白支架和β-TCP负载VAN/PLGA复合支架的平均孔隙率分别为(65.27±2.37)%和(55.39±1.76)%，差异具有统计学意义(t=2.552，P=0.032)。

2.3 药物缓释率

精密称取一定量的VAN用PBS溶解，配置成浓度为10、20、40、80、160 μg/mL的溶液，分别测量其260 nm处的吸光度(A)，以VAN浓度为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线(图3)，呈现良好的线性关系。根据VAN 标准曲线测得VAN/PLGA微球对VAN的药物负载率为(17.42±1.85)%，包封率为(35.13±3.59)%。

图3 VAN标准曲线

体外药物释放实验结果显示，VAN微球的释放率远高于β-TCP负载VAN/PLGA复合支架的释放率，差异具有统计学意义(P<0.05)，随着时间的延长，由于壳聚糖对复合支架的包被逐渐减弱，释放率也随之增加，在24 d时VAN微球释放率达80%，复合支架释放率达50%，还可以继续释放，在体内维持长时间的抑菌效果，见图4。

图4 药物累积释放曲线

2.4 复合支架力学性能

力学性能结果表明，3D打印β-TCP支架最大负荷为(107.83±7.81)N，最大强度为(3.02±0.21)MPa；
β-TCP负载VAN/PLGA复合支架最大负荷为(174.50±7.80)N，最大强度为(4.83±0.25)MPa，与空白支架相比差异均有统计学意义(t=10.462，t=9.901，P<0.001)。

2.5 体外降解实验

体外降解实验可以看出，β-TCP空白支架和复合支架在SBF模拟液中均逐渐降解，早期降解速度较慢，随时间的延长降解速度也随之加快，在14周时β-TCP空白支架已降解完全，而负载VAN/PLGA复合β-TCP支架第20周时才能彻底降解，见图4。

图4 体外降解曲线

3D打印技术在多个领域得到了广泛应用，特别是在医疗方面有较高的应用价值，如髋关节、膝关节、牙齿等的3D打印[11]。TCP作为日常钙源之一，相比其他补钙产品，其优势在于可同时提供钙和磷，钙和磷两种矿物质是骨骼形成的必需物质，在体内维持平衡非常重要[12]。大量实验研究已证实β-TCP 虽然可在骨骼接合界面产生分解、吸收和析出等反应，实现牢固结合，但其材质比较脆，柔韧性能差，力学承受能力也较低，不容易塑型[13]。另有研究表明，PLGA包埋微球在体内释放时，可形成一种偏酸的液体环境，破坏体内平衡，选取一种碱性物质与其中和，则能有效维持体内酸碱度平衡[14]。而壳聚糖是甲壳质脱乙酰反应后的产品，它作为一种天然高分子材料，具有良好的血液相容性、安全性和微生物降解等优良性能，将β-TCP与壳聚糖复合后，可以调节支架机械强度、机械效率，满足组织力学和生理需要[15]。

β-TCP负载VAN/PLGA缓释微球复合支架能否用于临床上治疗感染性骨缺损需要多方面的考察。研究表明，由于3D打印支架多孔的存在，使得该支架的表面积较传统支架大大增加，明显提高了载药量和缓释时间，能够长时间起到骨修复作用[16]。还有研究证实，将β-TCP支架与VAN/PLGA微球结合后，相对于空白的β-TCP支架，复合支架承受的机械强度明显增大，抗压强度从2.90 MPa升高到4.19 MPa，韧性从0.17 MPa升高到1.44 MPa，改善了其力学性能的同时仍保持良好的生物活性和降解性能[17]。除了对复合支架载药量、缓释率及力学性能等的表征评价外，体内外实验研究也是对复合支架骨修复能力评估的重要指标。韩倩倩等[18]研究表明3D打印β-TCP复合淫羊藿苷支架植入股骨头坏死模型兔体内，可促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞活性，同时促进新生血管生成，具有促进兔股骨头坏死修复的作用。Samaszko-Fiertek等[19]将万古霉素壳聚糖缓释液加到培养金黄色葡萄球菌的固体培养基中，每隔24h测量抑菌圈大小，结果显示万古霉素壳聚糖缓释微球可以抑制金黄色葡萄球菌的增长。

本实验选用壳聚糖溶液去包被β-TCP支架，使支架表面附着一层带正电荷的薄膜，该薄膜能与带负电荷的VAN/PLGA微球互相吸引，形成一种具有抗感染功能的复合支架。同时，壳聚糖是一种碱性多糖聚合物，可在弱酸环境下溶解并产生碱性物质，能中和PLGA释放的酸性物质，维持体内酸碱度平衡。本实验中3D打印多孔β-TCP负载VAN/PLGA微球复合支架与β-TCP空白支架比较，孔隙率有所下降，其原因可能是空白支架孔隙中吸附了缓释微球；
复合支架最大负荷和最大强度均有所提升，主要原因是β-TCP与壳聚糖复合能增强支架韧性和强度，与文献报道相吻合。此外，负载VAN/PLGA微球的复合β-TCP支架体外降解时间有所延长，并且在早期阶段降解速度比空白β-TCP支架缓慢，提示壳聚糖包被VAN/PLGA胶囊能减缓释药物释放速率，延长药物在体内的降解时间，减少机体因药物不耐受而引起的不良反应，长时间起到抗菌修复作用。

3D打印技术制作的多孔β-TCP负载VAN/PLGA缓释微球复合支架具有良好的缓释性能、力学性能和抗感染修复功能，能作为修复骨缺损的优良材料。后期将对该复合支架进行体内实验(新西兰兔)，观察复合支架体内局部抗感染效果、骨缺损修复能力，同时也为临床应用提供实验依据，最终为感染性骨缺损的治疗寻找一种全新的治疗方法。