提高原人参二醇口服生物利用度的固体分散体及其片剂的制备与评价

刘春雨，赵云，廖永红，杨飞飞

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

20(S)-原人参二醇(protopanaxadiol，PPD)为二醇型人参皂苷元，天然来源于人参、西洋参、三七等五加科植物，以及绞股蓝等葫芦科植物。商品PPD常通过微生物酵解二醇组人参皂苷获得[1-2]。PPD具有免疫调节、抗肿瘤、提高学习记忆、抗衰老、抗炎、抗痴呆、抗焦虑、抗抑郁、抗疲劳和促进造血等广泛的药理活性[1-2]。但PPD水溶性较差，在水中的平衡溶解度仅为35.24 mg·L-1，油水分配系数(P)为46.21(logP=1.66)，肠灌流模型和细胞模型表明PPD的膜渗透性好，因此PPD属于生物药剂学分类系统中属于溶解性差，渗透性好的第二类药物[3]。对于此类药物，溶出是药物吸收的限速步骤，影响药物口服生物利用度，改善药物溶出为常用的提高此类药物生物利用度的制剂方法[4]。文献报道了采用纳米晶、自微乳和聚合物胶束等手段有效提高PPD溶出和口服生物利用度的研究[5-8]，其中基于纳米晶技术的方法表现出较好的应用前景。本文拟报道一种新型PPD固体分散体，其加水复溶后可转化为纳米混悬液，改善PPD的溶解度、溶出度和口服生物利用度。

1.1 仪器 E2695-2489高效液相色谱仪(美国Waters公司)；
3200 Q-TRAP液相色谱-质谱联用仪LC-MS/MS(美国Applied Biosystem公司)；
Analyst 1.4 数据处理系统(美国Applied Biosystem公司)；
XS105S 十万分之一电子天平(瑞士 Mettler Toledo 公司)；
Gilson 移液器(法国 Gilson 公司)；
Vortex-5 涡旋混匀器(江苏其林贝尔仪器制造有限公司)；
台式微量高速冷冻离心机(Micro 17R，美国Thermo Scientific公司)；
旋转蒸发仪(德国 Heidolph公司)。

1.2 试剂 原人参二醇(≥95%，北京博肽未名生物技术有限公司)；
PPD和地高辛标准品(阿拉丁试剂有限责任公司)；
乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯共聚64(PVP-VA，上海维酮材料科技有限公司)；
D-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯(TPGS，西安海斯夫生物科技有限公司)；
聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP，北京益利精细化学品有限公司)；
泊洛沙姆188(F68，北京风礼精求商贸有限责任公司)；
色谱级乙腈和甲醇(德国Merk公司)；
无水乙醇(北京化工厂)；
实验用水为娃哈哈纯净水；
其余试剂均为国产分析纯。

2.1 PPD体外含量测定方法 PPD体外含量测定采用HPLC方法，具体条件是色谱柱：Thermo BDSHYPERSIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，流速：1 mL·min-1，检测波长：203 nm，进样量：50 μL，流动相：10%水∶90%乙腈。

2.2 PPD固体分散体处方筛选和优化 处方筛选拟评价F68和TPGS两种表面活性剂的固体分散体处方。PPD固体分散体采用溶剂蒸发法制备，具体是按表1称取处方量的PPD和辅料于圆底烧瓶中，加入适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除去溶剂，圆底烧瓶密封置于-20 ℃冰箱中固化20 min，取出后过200目筛，置干燥器中避光保存。处方优化的目的是提高PPD载药量和减少辅料的用量，具体处方见表2。

表1 PPD固体分散体制备处方组成

表2 PPD固体分散体制备处方优化组方

2.3 固体分散体复溶后的粒径分布 取10 mg PPD固体分散体复溶在5 mL人工胃液中，然后用马尔文激光粒度(ZetasizerNanoZS 90)测定其平衡10 min和放置8 h后的平均粒径和多分散指数(PDI)。

2.4 PPD固体分散体片剂的制备 PPD固体分散体在处方中为主药，每片PPD含量为100 mg。根据预试验结果，以压片物料的流动性、片剂的可压性、崩解时间及外观光洁度作为评价制剂质量的指标，对分散片的崩解剂、填充剂及润滑剂的种类及用量进行筛选。在单因素考察试验中，按基本处方进行试验：PPD固体分散体(含PPD 100 mg)80%、填充剂10%，崩解剂9%、润滑剂1%。以乳糖、可压性淀粉和微晶纤维素(MCC)为填充剂，硬脂酸镁为润滑剂，崩解剂选择羧甲基淀粉钠(CMS-Na)、交联聚维酮(PPVP)或交联羧甲纤维素钠(CC-Na)。

采用直接压片法制备固体分散体片剂。具体是将PPD固体分散体过80目筛，其他辅料过100目筛，按处方量分别称取主药PPD固体分散体及各种辅料，混合均匀，最后加上润滑剂过100目筛，混合均匀，检验合格后压片即可。取PPD固体分散片，照崩解时限检查法[《中国药典》2015年版(二部)附录XA]，测定片剂崩解时间。

2.5 PPD固体分散片体外溶出试验 比较优化后的固体分散体和原药经相同处方物理混合压片的片剂的体外溶出度。分别取两种自制片各6 片，以纯水为溶出介质，参照《中国药典》2015 年版片剂溶出度测定法(浆法)进行考察。溶出介质为500 mL，转速为120 r·min-1，温度设置为(37±2)℃，分别在第15、30、60、90、120、240、360、480 min 取样，用微孔滤膜过滤，滤过液经90%的甲醇溶液稀释后，用HPLC进样分析。

2.6 药代动力学研究

2.6.1 实验动物 全部实验动物在中国医学科学院药用植物研究所动物伦理委员会要指导下进行实验研究。雄性Wistar大鼠(180～220 g，8周)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK-京2012-0001)，实验前在SPF动物房适应性饲养7 d。所有动物均保持在控制温度(22±2)℃，12 h光照/黑暗周期，并自由饮食和饮水。

2.6.2 颈静脉插管手术 将大鼠腹腔注射40 mg·kg-1戊巴比妥钠生理盐水溶液，深度麻醉后，在右嘴角向锁骨处做一条垂线，在交点上方约0.5 cm的部位，用剪刀将皮肤剪开一个1 cm 左右的切口，钝性分离颈静脉，并将其远心端结扎，在颈静脉窦远心方向约0.5 cm处剪一个小切口，沿切口处向心脏方向插入约2.5 cm的聚乙烯管(ID 0.5 mm，OD 1 mm，英国Portex公司)，并将聚乙烯管末端沿皮下在背部导出，用肝素生理盐水溶液封管，结扎固定，缝合开口。术后至少恢复12 h以上。所有动物给药前禁食不禁水。

2.6.3 大鼠口服灌胃给药和取血样 雄性Wistar大鼠插管手术恢复后随机分成2组，每组6只，标号后灌胃给予PPD固体分散片和PPD物理混合片剂。给药前片剂按3 mg⋅mL-1的PPD浓度分散在水中，给药体积为10 mL·kg-1灌胃给药，相当于PPD剂量为30 mg·kg-1。给药后分别在15、30、45、60、120、180、240、360、720 min时间点从颈静脉置留管中取全血约0.12 mL放于含有抗凝剂肝素的EP管中，5 000 r·min-1离心5 min收集得50 μL血浆，冷冻储存待用。

2.6.4 样品处理方法 取50 μL血浆置于2 mL离心管中，加入内标地高辛(250 μg·mL-1)10 μL和40 μL磷酸缓冲液，涡旋震荡5 min。加入二氯甲烷1.5 mL，涡旋震荡10 min，12 000 r·min-1离心5 min，小心吸取溶液，高纯氮气吹干挥发掉有机溶剂，残渣加入100 μL 80%甲醇复溶，涡旋震荡1 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清经HPLC-MS/MS分析检测。

2.6.5 LC-MS/MS血浆样品分析方法 LC-MS/MS血浆样品分析方法采用作者前期报道的方法[11]。

2.6.6 统计学方法 使用WinNonlin软件(版本6.1，美国Pharsight公司)计算药代动力学参数。包括最高血药浓度(Cmax)，最高血药浓度时间(Tmax)，半衰期(t1/2)和生物利用度(AUC0～t)。

3.1 PPD固体分散体处方优化 PPD和PVP或PVP-VA溶于乙醇溶液后，经旋转浓缩干燥后可形成固体分散体，复溶于水后，药物溶液沉淀。当在其中加入F68或TPGS后，复溶后可形成纳米混悬液。尤其是在PVP-VA中加入TPGS后，固体分散体复溶后可形成平均粒径小于120 nm的纳米混悬液(见表3)。因此进一步处方优化选用PVP-VA作为固体分散体的分散载体材料。考虑到表面活性剂可能对胃肠道存在一定的毒副作用，在处方优化时，表面活性剂用量尽量减小。

表3 不同固体分散体处方粒径结果

表4 不同固体分散体处方粒径结果

3.2 PPD固体分散片处方优化 优选的PPD固体分散体可直接压成片剂，但片剂遇水后黏性很大，难以崩解。因此考虑在压片时加入一定量的常用崩解剂和填充剂。在CMS-Na、CCNa和PPVP 3种崩解剂中，CMS-Na和CCNa的崩解效果不显著，而PPVP吸水膨胀性强，观察结果显示其有很好的崩解效果(见表5)，因此选用PPVP为PPD固体分散体片剂的崩解剂。

在常用片剂辅料中，MCC既可作填充剂，还具有一定促崩解作用，本研究中，使用MCC的PPD片剂表面光滑，可压性优于其他辅料，但使用MCC的片剂反而不易崩解。和可压性淀粉相比，乳糖的可压性和崩解性能均优于淀粉，因此选择乳糖作为填充剂。当固定崩解剂和填充剂总量为处方量为19%，乳糖∶PPVP为1∶3时，崩解时间可缩短至约9 min，且可压性良好(见表5)。由此确定PPD固体分散片优化处方为：PPD固体分散体PVP-VA-TPGS-2 80%、填充剂乳糖4%、崩解剂PPVP 15%、润滑剂硬脂酸镁1%，片剂中PPD的含量为25%。

表5 辅料对片剂性能的影响筛选结果

对优化后的固体分散片，以及基于固体分散材料物理混合的片剂进行了体外溶出试验。在物理混合的片剂中，PPD原药的平均粒径为(17.4±0.8)μm。从图1中的溶出结果可知，固体分散片在15 min时溶出量超过了90%，而物理混合的片剂15 min时只有约10%的药物溶出。需要注意的是，溶出的药物是以纳米混悬的形式存在，而不是药物分子形式溶出，因为溶出液采用0.22 μm滤膜过滤，分散体复溶形成的纳米粒可经滤膜过滤。

图1 PPD固体分散体和物理混合物的体外溶出曲线

3.3 药代动力学结果 大鼠口服PPD固体分散体和物理混合物的药-时曲线和药代动力学参数见图2和表6。由结果可知，固体分散体口服给药后可快速吸收入血，达峰时间为30 min，而物理混合物的PPD则显示出缓慢吸收的特性，没有明显的达峰时间。固体分散体的快速溶出显著提高了其最高血药浓度达6.59倍，同时其相对生物利用度也是物理混合物的2.54倍。

图2 PPD固体分散体和物理混合物以30 mg·kg-1剂量经大鼠口服给药后的药时曲线

表6 PPD固体分散体和物理混合物以30 mg·kg-1剂量经大鼠口服给药后的的药动学参数

固体分散技术可以显著增加难溶性药物的溶解度和溶出速率，提高药物生物利用度。人参皂苷元PPD在水中的溶解度低，通过固体分散技术，提高其在水中的溶解度。口服固体分散体在胃肠道复溶后，药物形成过饱和溶液。溶解后的药物分子经历吸收和重结晶两个过程的相互竞争[9]。传统的固体分散技术是通过选择适当的辅料材料，延长药物在胃肠道的过饱和状态，抑制药物重结晶，从而提高难溶性药物的口服生物利用度。但延长药物的过饱和状态并不容易，一般载药量超过5%时，很难形成稳定的过饱和溶液。

本文研究了一种新型溶出机制的固体分散体。在固体分散体复溶时，不是通过提高过饱和溶液的稳定性，而是加速过饱和溶液中药物重结晶，通过控制重结晶后药物的粒径，使其形成稳定的纳米混悬液，提高PPD的溶出特性。当TPGS用量从处方量的33%减少到20%时，复溶后的纳米混悬液平均粒径略有增加，从约(101.6±4.2)nm增大到(115.1±1.5)nm，纳米混悬液放置8 h后略有增大，分别增大到(124.3±2.9)nm和(136.7±0.7)nm。当继续降低TPGS的用量时，复溶的纳米混悬液的粒径开始增大，并且在酸性介质中放置8 h下出现沉淀。因此，优选的固体分散体处方PPD∶PVP-VA∶TPGS组成为100∶140∶60。固体分散体中加入表面活性剂可抑制药物结晶，并提高终产品片剂的物理稳定性。当终产品进行溶出测试时，在没有考虑复溶溶剂的漏槽条件情况下形成至少稳定8 h的纳米混悬剂。

体内药代动力学结果发现，固体分散体经大鼠口服后可以显著提高PPD的口服生物利用度。利用控制结晶法制备PPD纳米晶提高药物溶出特性和口服生物利用度的方法已有研究报道。在该研究中，Chen等[10]利用反溶剂法将溶有高浓度PPD的有机溶剂滴加到含有保护剂的水相中，PPD可通过控制重结晶过程制备药物纳米晶，含有表面活性剂作为保护剂的PPD纳米晶混悬液的Cmax和生物利用度分别是原药制剂4.74倍和1.81倍。在本研究中，固体分散体Cmax和生物利用度分别是原药及辅料物理混合物的6.59倍和2.54倍，说明固体分散体原位形成的纳米混悬液具有更好的增溶作用。同时，本文研究发现当固体分散体不含表面活性剂时，复溶后的药物迅速重结晶形成大的颗粒而沉淀；
而加入表面活性剂可控制PPD结晶后的粒径大小，比较而言，加入TPGS可形成比F68更小的纳米颗粒。这一采用表面活性剂控制结晶的策略和文献纳米晶的制备方法基本一致，并具有类似的控制效果[11]。和纳米晶口服药物制剂相比，本研究中的可转化为纳米混悬剂的固体分散体具有两个优势：首先制备简单，可直接通过真空干燥法制备固体分散体，然后制备为片剂；
其次所需的表面活性剂的用量更低，因为基于固体分散体的纳米混悬剂是在溶出部位原位形成的，局部的表面活性浓度高，因此需要的表面活性剂用量更低。