DCE-MRI,Ktrans图纹理分析与代谢组学评价糖尿病兔早期骨髓微血管病变

王焰，胡磊，闫玉辰，张甜，陈俊，查云飞

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以高血糖为主要特点的慢性代谢性疾病。长期患有1型和2型糖尿病的患者可能会出现骨质疏松、骨质减少、骨关节病变和低应力骨折的风险增加[1-2]。研究表明糖尿病骨病可能是一种慢性骨髓微血管并发症[3]。Hu等[4]研究结果显示基于药代动力学模型的动态对比增强MRI(dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)和非对称回波的最小二乘估算法迭代水脂分离方法(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetrical and least-squares estimation quantitation sequence，IDEAL-IQ)序列可用于定量评估四氧嘧啶诱导的糖尿病兔椎体微血管通透性和椎体脂肪沉积的变化。

纹理分析是影像组学的重要组成部分，是图像中局部不规则而宏观有规律的灰度特性，对区域内部灰度级变化的特征进行量化。近年来纹理分析在骨病变以及肿瘤的预测、诊断和鉴别诊断、疗效评估及预后等方面均显示出较大应用价值[5]。

代谢组学作为一种研究生物系统内小分子代谢物的新兴技术，揭示了常规研究方法无法发现的疾病发生发展的差异代谢通路及潜在的生物标志物，为早期有效控制疾病发生提供了新的靶点[6]。目前尚未见基于DCE-MRI容量转移常数(volume transfer constant，Ktrans)图纹理分析和代谢组学联合评价糖尿病骨髓微血管病变的研究报道，本研究旨在探索基于DCE-MRI Ktrans图纹理分析和代谢组学的整合生物标志物评价糖尿病早期骨髓微血管病变的可行性。

1.兔糖尿病模型的制备

本研究经武汉大学人民医院伦理委员会审查通过。28只3月龄健康日本雄性大耳白兔由武汉大学动物实验中心提供，平均(3.2±0.2) kg。所有兔经过1周适应性饲养，测量空腹血糖均在正常水平。28只兔随机分为糖尿病组14只，对照组14只。糖尿病组兔的造模方法同Hu等[4]研究一致。单次血糖值大于14 mmol/L或2次血糖值大于11 mmol/L，认定造模成功[7]。48 h后血糖值仍处于正常范围的糖尿病组兔补加50 mg/kg四氧嘧啶，直到血糖值达到上述标准。4周以后两组兔血糖水平趋于稳定，每次行MRI检查前测量其血糖值。

2.MRI成像及后处理

实验兔在第0、4、8、12、16周从耳缘静脉注射戊巴比妥钠溶液(3%，2 mL/kg)麻醉，摆放体位呈仰卧位、足先进，在3.0T MRI设备(Discovery MR750 Plus，GE Healthcare，Milwaukee)上固定8通道膝关节专用相控阵线圈，扫描序列及参数：常规腰椎矢状面FSE-T1WI：TR 300 ms，TE 12 ms，翻转角142°，层厚3 mm，视野16 cm×16 cm，矩阵320×288；
FSE-T2WI：TR 2500 ms，TE 120 ms，翻转角142°，层厚3 mm，视野16 cm×16 cm，矩阵320×320；
DCE-MRI：采用肝脏快速容积采集(liver acquisition volume acceleration，LAVA) 及阵列空间敏感编码技术(array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)，TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，翻转角6°，9°，12°，层厚3 mm，视野20 cm×20 cm，矩阵192×192，首先行多翻转角(6°、9°、12°)LAVA序列扫描，扫描3个时相，随后行动态增强LAVA序列扫描(翻转角为12°)。在基线扫描3个动态时相之后采用双筒高压注射器经兔耳缘静脉注射钆双胺，剂量0.2 mmol/kg，流率为1.0 mL/s，随后以相同流率注射5 mL 0.9%生理盐水冲管。

将DCE-MRI原始数据导入Omni-Kinetics(GE Healthcare)软件进行分析。选取最亮一期腰椎中心层面图像，在腰5-7椎体手动勾画感兴趣区(region of interest，ROI)，避开椎间盘、终板、椎基静脉丛、脑脊液，采用药代动力学Extended Tofts Linear双室模型得到Ktrans图，自动提取76个纹理特征，包括灰度直方图特征、灰度共生矩阵特征以及灰度游程矩特征。由两名有3年(医师A)和5年(医师B)以上骨肌 MR诊断经验、对分组不知情的影像诊断医师进行上述所有测量，获得的数据取平均值进行分析(图1)。采用组内相关系数(intraclass correlation coefficient，ICC)评估医师A和医师B之间的一致性，1个月后医师A对全部病变再次勾画ROI，计算观察者内ICC。

图1 a)第16周糖尿病组FSE-T1WI图；
b)FSE-T2WI图；
c)DCE-MRI图，红色区域为手动勾画出的腰椎ROI；
d)Ktrans图。

3.兔腰椎骨髓样品采集

在第16周完成检查后，经耳缘静脉注入100 mg/kg戊巴比妥钠对所有实验兔实施安乐死。取腰5、6椎体做病理学检查；
取腰7椎体压碎取出骨髓液氮速冻，-80℃保存做液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS)代谢组学。

4.兔腰椎骨髓代谢组学LC-MS检测

本次实验的分析仪器为Ultimate 3000超高效液相串联Q Exactive(Thermo Fisher Scientific，USA)高分辨质谱仪组成的液质联用系统。将2 μL经过前处理的样本上样至保持在35℃的AQ C18色谱柱(150×2.1 mm 1.8 um，Utimate)。然后在含0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸胺的乙腈/水(3：2)溶液(A液)和含0.1%甲酸、10 mmol/L 乙酸胺的异丙醇/乙腈(9：1)溶液(B液)的正离子模式流动相中以0.3 mL/min的恒定流速洗涤色谱柱。质谱条件：扫描模式负离子扫描模式；
检测方式Full mass/dd-MS2；
分辨率70000(Full mass)；
17500(dd-MS2)；
电喷雾电压2.8 kV；
毛细管温度320℃；
鞘气流速40 Arb；
雾化器温度350℃。

5.兔腰椎骨髓病理学检查

采用10%多聚甲醛固定腰5、6椎体，脱钙两周后，石蜡包埋，沿椎体短轴位作4 μm切片，行CD34免疫组化染色。免疫组化染色测量组织内微血管密度(microvessel density，MVD)的方法：CD34表达于血管内皮细胞，以血管内皮细胞的胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。在光学显微镜下拍片，同一研究者随机选取3个相互不连续区域，然后在200倍光镜下计数染色呈阳性的血管数，测量结果的平均值作为MVD值。

6.统计学分析

第16周基于Ktrans图的纹理分析数据首先通过ANOVA或Mann-WhitneyU检验评估两组纹理参数的差异，对剩余的纹理特征进行单因素Logistic回归分析筛选出有统计学意义的纹理参数特征值。

采用Analysis Base File Converter将LC-MS原始数据转换成通用(adf)格式。在MSDIAL软件平台下，进行峰的识别、保留时间校正等预处理，得到一个负离子模式下代谢物名称、质荷比等的可视化矩阵。通过主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least square-discriminant analysis，PLS-DA)识别和分析糖尿病组和对照组骨髓代谢轮廓的整体差异。对PLS-DA结果进行交叉验证，以R2和Q2值作为验证模型质量的标准。分别计算每个代谢物的变量重要性投影(variable importance in projection，VIP)值和变化倍数(fold change，FC)值。选择VIP>1和FC>2或FC<0.5的代谢物进一步进行功能分析。采用R studio软件(版本4.0.3)，通过富集分析和拓扑分析进行通路分析，识别糖尿病组显著差异的代谢通路及差异代谢物。

采用Spearman相关性系数评估MVD、差异代谢物水平与基于Ktrans图纹理分析特征值的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

图2 a、b)分别为PCA图和PLS-DA图，表明糖尿病组(Dg：绿色小圆形和绿色椭圆)和对照组(Cg：红色小圆形和红色椭圆)代谢谱具有分开趋势；
c)火山图显示所有代谢物和差异代谢物的分布，横轴是log2(FC)，纵轴是-log10(P)，每一个点代表一个代谢物。

表1 第16周基于DCE-MRI Ktrans图纹理参数特征值的单因素Logistic回归结果

表2 差异代谢物确定的富集代谢通路

在实验期间3只糖尿病兔因麻醉意外、健康状况差死亡，1只血糖恢复正常；
对照组因健康状况差死亡2只，2只实施安乐死。

1.基于DCE-MRI Ktrans图的纹理分析

各序列纹理特征测量值的观察者间及观察者自身ICC为0.80～0.92(P< 0.01)，表明一致性良好。第16周基于Ktrans图的纹理参数共有76个，通过ANOVA和Mann-WhitneyU检验筛选出25个特征；
对剩下的25个特征进行单因素Logistic回归分析进一步筛选，筛选出9个特征(表1)。

2.腰椎骨髓代谢组学分析

对所有实验兔腰7椎体骨髓进行LC-MS分析，PCA图、PLSDA图显示糖尿病组和对照组具有分开趋势(图2)。结果显示PLS-DA模型的R2值为80%，Q2值为10%。本研究基于VIP>1和FC>2或FC<0.5筛选出36种差异代谢物。通过富集分析和拓扑分析进行通路分析，识别糖尿病组显著差异的代谢通路。相关代谢通路有11条(表2)，其中具有显著差异的代谢通路为亚油酸代谢通路，主要包括5个差异代谢物，4个磷脂酰胆碱(phosphatidyl cholines，PC) 和1个脂肪酸(fatty acid，FA)，分别是PC 14:0～16:0、PC 15:0～18:1、PC 18:0～20:2、PC 18:1～20:1、FA 18:2。

图3 a)对照组兔腰椎骨髓CD34染色(×200)；
b)糖尿病组兔腰椎骨髓CD34染色示微血管(箭)减少(×200)。

3.组织病理学

CD34免疫组化检查显示第16周糖尿病组腰椎骨髓的MVD较对照组明显减少(图3)，差异有统计学意义(Z=-3.785，P<0.01)。

4.相关性分析

相关性分析结果显示Median Intensity、Quantile50、Quantile75与MVD呈负相关(r=-0.504，P=0.023；
r=-0.490，P=0.028；
r=-0.541，P=0.014)，其余纹理参数特征值与MVD均无相关性(P均>0.05)。差异代谢物与纹理参数特征值无相关性(P均>0.05)。

本研究首次基于DCE-MRI Ktrans图纹理分析与代谢组学整合评价糖尿病兔早期骨髓微血管病变。基于第16周DCE-MRI Ktrans图筛选出纹理参数特征值有9个。糖尿病早期骨髓微血管病变与脂质代谢紊乱有关，主要与亚油酸代谢有关。Median Intensity、Quantile50、Quantile75与MVD呈负相关，差异代谢物与纹理参数特征值无显著相关关系。

第16周基于DCE-MRI Ktrans图的纹理分析结果显示糖尿病组和对照组有统计学差异的纹理参数有Median Intensity、Mean Deviation、Quantile50、Quantile75、Quantile95、RMS、sum Average、difference Entropy、Mean Value，说明基于DCE-MRI Ktrans图的纹理参数反映了糖尿病骨早期骨髓细微结构变化。Median Intensity、Quantile50、Quantile75与MVD呈负相关，表明骨髓微血管病变影响到骨髓细微结构，导致了骨髓纹理参数值出现变化，与杨柳等[8]研究结论一致。此外有研究证明基于DCE-MRI Ktrans图的纹理分析可识别糖尿病早期骨骼肌微结构变化[9-10]，说明基于DCE-MRI Ktrans图的纹理分析是识别糖尿病骨肌病变的有力工具。

已有研究发现亚油酸代谢异常与糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病有关[11-12]，糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病属于糖尿病微血管病变。Hu等[4]采用IDEAL-IQ技术研究显示糖尿病兔椎体骨髓脂肪含量在第16周显著增加，目前尚未见糖尿病骨髓微血管病变脂肪酸改变的研究报道。本研究首次揭示了糖尿病早期骨髓微血管病变与脂质代谢紊乱有关，主要与亚油酸通路改变有关。亚油酸属于多不饱和脂肪酸。早前已有研究证实糖尿病脂质代谢紊乱导致的高胆固醇、高甘油三酯血症以及多不饱和脂肪酸成分变化可通过损害内皮祖细胞的数量和功能引发内皮功能障碍[13-14]。内皮功能失调是糖尿病多个靶器官微血管病变并发症发生和进展的中心环节[15-16]。此外Bellissimo等[17]通过血浆LC-MS研究发现与脂肪酸代谢相关的通路，尤其是亚油酸相关代谢通路与骨密度显著相关。花生四烯酸是亚油酸的代谢产物，是促炎类花生酸的的主要前体[18-20]，通过前列腺素E2诱导人骨髓破骨细胞形成和骨吸收[21]。亚油酸衍生的氧化脂类包括9-羟基十八碳二烯酸和13-羟基十八碳二烯酸，是过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂，可促进间充质干细胞向脂肪细胞分化，但不利于成骨细胞分化[22-23]。亚油酸通路相关代谢物可能是糖尿病早期骨髓微血管病变的潜在生物标志物。监测亚油酸通路相关代谢物水平可能进一步实现糖尿病早期微血管病变预测和早期诊断。本研究结果显示糖尿病兔腰椎骨髓差异代谢物与纹理参数特征值无相关性，可能是不同组学数据存在差异性，导致了评估模型的方法不一样，如何采用高效、有效的整合方法或算法模型对不同组学数据进行整合，挖掘多组学数据中隐含的信息及规律是一个亟待解决的问题。

本次研究的局限性：首先，研究样本量有限，可能会影响纹理分析结果的准确性。其次，本次实验对象是动物，研究时长为16周，与临床糖尿病患者慢性代谢性疾病自然病程存在差异。第三，本研究没有揭示糖尿病早期骨髓微血管病变差异代谢物、基于DCE-MRI Ktrans图纹理参数特征值改变的时序性。第四，胰岛素对血管的作用也可能导致骨髓微血管的改变，本研究未考虑胰岛素对骨髓微血管的影响。

综上所述，基于DCE-MRI Ktrans图的纹理参数可识别糖尿病早期骨髓细微结构变化，糖尿病早期骨髓微血管病变与脂质代谢有关，主要与亚油酸代谢通路异常有关。基于DCE-MRI Ktrans图纹理分析和代谢组学整合研究评价糖尿病早期骨髓微血管病变是可行的。