Klotho蛋白及血钙与重度子痫前期的关系研究

刘夕珑，卢丹，荣茜，邢悦，潘碧琼

(扬州大学，扬州大学临床医学院 妇产科，江苏 扬州 225000)

子痫前期(PE) 是妊娠特有疾病，是一种病情可呈持续性发展的动态疾病，患者可出现血压增高、蛋白尿、水肿、头痛、视力模糊、上腹疼痛甚至抽搐、昏迷等症状。有文献报道，子痫前期在孕妇中患病率约为5%，重度子痫前期(SPE) 及其并发症，如胎儿生长受限、脑血管意外、肝肾功能衰竭、胎盘早剥、产后出血等，是围产期母儿死亡的重要原因。重度子痫前期是妊娠期高血压较严重的一种类型，其发病机制现尚未明确。研究发现，子痫前期的发生与子宫螺旋动脉重铸不足、血管内皮细胞损伤，氧化应激、胎盘植入及免疫功能等密切相关。Klotho 蛋白是肾脏分泌的一种抗衰老蛋白，在胎盘合胞滋养细胞中也有少量分泌，研究发现Klotho 蛋白在调节钙磷代谢、抗氧化、抗凋亡以及对脏器的保护方面有广阔的应用前景，本实验通过免疫组化法测定试验组胎盘中Klotho 蛋白的表达，联合孕妇血清Ca浓度，为重度子痫前期的早诊断、早治疗提供新的处理依据。

1.1 一般资料

研究对象选取扬州大学临床医学院2020年8月至2021年3月产科住院的83 例终止妊娠产妇，其中重度子痫前期患者43 例作为试验组，正常孕妇40 例作为对照组，分娩后收集胎盘及脐血标本并进行相关处理。

诊断标准：SPE 诊断标准依据人卫版第九版《妇产科学》：在PE 的基础上合并以下任何一种表现：(1)收缩压≥160 mmHg，或舒张压≥110 mmHg(卧床休息，两次间隔至少4 h)；
(2) 血小板减少(血小板＜100×10/L)；
(3) 右上腹或上腹部疼痛；
肝功能损害(血清转氨酶水平为正常值2 倍以上)；
(4) 肾功能损害(血肌酐升高大于97.2 μmol/L 或为正常值2 倍以上)；
(5) 肺水肿；
(6) 新发生的脑功能或视觉障碍如头痛视力模糊盲点复视等；
(7) 胎儿生长受限(FGR)。

纳入标准：(1) 所有研究对象均为单胎妊娠且胎儿发育无异常，(2) 既往均无糖尿病、心脏病及肝、肾疾病史，(3) 无其他妊娠合并症及并发症。

排除标准：(1) 非单胎妊娠如双胎及以上；
(2) 本次妊娠通过辅助生殖技术受孕，包括人工授精、体外受精—胚胎移植等；
(3)既往有慢性高血压、慢性肾炎、严重心、肝等脏器疾病、神经系统疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮等相关病史；
(4) 孕期感染急慢性炎症；
(5) 患者资料不全及拒绝者。

孕妇诊断为SPE 收住入院予以吸氧、解痉、降压、镇静和促胎肺成熟等治疗，密切监测孕妇自觉症状、生命体征、血压、尿蛋白、血小板、凝血功能、肝肾功能等变化及胎儿宫内情况，根据病情变化适时终止妊娠。本研究通过本院伦理委员会审批，所有患者的数据资料及标本的收集均获得患者本人的知情同意并签署了知情同意书。

1.2 资料收集

收集两组孕妇入院时到分娩后的一般情况，包括：年龄、BMI、分娩孕周、孕次及产次、血压；
收集两组研究对象的血样；
分析比较两组孕妇血清钙离子浓度。分娩后至出院前比较两组产妇妊娠并发症，如子痫、脑血管意外、HELLP 综合征、低白蛋白血症、妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)、肝功能异常、胎儿生长受限(FGR)、胎盘早剥、视网膜病变、胸腹水、肺动脉高压、分娩情况、产后出血、产褥感染发生情况及新生儿情况。

1.3 试剂

兔抗人Klotho 多克隆抗体购自美国Abcam 公司，生物素标记山羊抗兔IgG、即用SABC 型免疫组化试剂盒及DAB 显色试剂盒购自迈新生物技术公司，ELISA 试剂盒购自SAB 公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化法测定胎盘组织Klotho 蛋白的表达

所有胎盘标本均于胎盘娩出后10 min 内收集，选择胎盘母体面的无钙化区，肉眼检查新鲜胎盘，并从胎盘中心区域获得无坏死或炎症迹象的胎盘部分，剪取全层胎盘组织，迅速用无菌生理盐水清洗干净血块和血液，干纱布净除水分，分割成大小约1 cm×1 cm×1 cm 的块状，放入冻存管，于-80℃冰箱保存。取用时常温解冻，置于10% 中性多聚甲醛液中固定24～48 h，然后常规制作成石蜡块，4℃保存待用。采用免疫组化SABC 法测定胎盘组织Klotho 蛋白的表达。

1.4.2 ELISA 法检测母血及脐血中Klotho 蛋白含量

所有孕妇入院后均禁食10～12 h，次日清晨采集空腹静脉血5 mL，3 000 r/min 离心5 min，取上清，-80℃冻存。新生儿断脐后10 min 内行脐血采集：选择距离胎盘断端约5～10 cm，碘伏消毒两遍，5 mL 注射器针头斜面朝下或侧面小角度刺入，见血后沿血管壁顺行1～2 cm，采集脐血2～5 mL，存于4 ℃冰箱，5 000 r/min 离心5 min，取上清，-80℃冻存。所有标本收齐后严格按照试剂盒操作步骤，ELISA 法检测母血及脐血中Klotho 蛋白浓度。

1.5 统计学方法

2.1 两组孕产妇一般情况比较

两组研究对象的孕次、产次、身高、孕期体重增长情况差异无统计学意义，实验组与对照组年龄、分娩孕周、收缩压及舒张压间差异具有统计学意义(＜0.05)。见表1。

表1 两组孕产妇一般情况比较[(±s )/M(P 25，P 75)]

2.2 两组孕妇母血钙比较

试验组血Ca(2.10±0.35)mmol/L 低于对照组(2.20±0.31)mmol/L，差异有统计学意义(＜0.05)。见表2。

表2 两组孕妇母血钙比较(±s)

2.3 胎盘组织的HE 染色

胎盘组织中可见成熟中间型绒毛，含毛细血管和细小动静脉，间质疏松，占绒毛体积的一半以上，血管腔占绒毛体积的一半以下，合体滋养细胞结构一致。见图1、图2。

图1 重度子痫前期胎盘组织HE 染色

图2 重度子痫前期胎盘组织HE 染色

2.4 Klotho 蛋白在胎盘组织的定位表达

在对照组中，Klotho 蛋白主要表达于胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及绒毛结缔组织间隙。见图3、图4。试验组Klotho 蛋白表达定位与对照组基本相同，但明显淡染，部分细胞中可见着色颗粒。见图5。

图3 正常胎盘组织中Klotho 蛋白的表达

图4 正常胎盘组织中Klotho 蛋白的表达

图5 重度子痫前期胎盘组织中Klotho 蛋白的表达

2.5 两组Klotho 蛋白在母血和脐血中的含量比较

Klotho 蛋白在对照组母血中含量为(233.80±117.20)pg/mL，在试验组母血中含量为(148.97±68.80)pg/mL，试验组低于对照组，但差异无统计学意义(＞0.05)；
Klotho 蛋白在对照组脐血中含量为(121.47±22.85)pg/mL，试验组脐血中含量为(62.73±28.86)pg/mL，试验组低于对照组，差异有统计学意义(＜0.05)。见表3。

表3 两组Klotho蛋白在母血和脐血中的含量比较

2.6 母血及脐血中Klotho 蛋白含量的ROC 曲线值

根据母血、脐血Klotho 蛋白浓度及血Ca浓度绘制其ROC 曲线，计算曲线下面积(AUC)，发现脐血中Klotho 蛋白含量AUC 值大于0.6，对重度子痫前期有一定的预测意义，当Klotho 蛋白浓度为75.69 pg/mL 时，其曲线下面积为0.818，其灵敏度为100%，特异度为58.3%，而母血中Klotho 蛋白含量的AUC 值小于0.6，无明显诊断价值。见表4。

表4 母血及脐血中Klotho 蛋白含量的ROC 曲线值

2.7 两组孕妇妊娠并发症及结局比较

试验组发生子痫1 例，低白蛋白血症16 例，ICP 8 例，肝功能异常5 例，FGR 6 例，胸腔积液1 例，肺动脉高压1 例，平产2 例，剖宫产41 例，产后出血1 例。对照组并发低白蛋白血症2 例，ICP 3 例，肝功能异常1 例，FGR 0 例，平产31 例，剖宫产9 例，产后出血1 例。试验组发生低白蛋白血症率、FGR 率高于对照组，剖宫产率亦增加，差异有统计学意义(＜0.05)。两组孕妇发生子痫、脑血管意外、ICP、肝功能异常、胎盘早剥、视网膜病变、胸腔积液、肺动脉高压、产后出血及产褥感染率差异无统计学意义(＞0.05)。究其原因，这可能与妊高病基本病理生理改变引起宫内胎儿、胎盘变化有关。见表5。

表5 两组孕妇妊娠并发症及结局比较[n(%)]

2.8 两组新生儿一般情况和结局比较

试验组发生FGR 6 例，早产15 例，新生儿死亡1例。试验组新生儿出生体重及胎龄均小于对照组，新生儿Apgar 1 min 评分低于对照组，差异具有统计学意义(＜0.05)，两组新生儿窒息及死亡率差异无统计学意义(＞0.05)。见表6。

表6 两组新生儿一般情况和结局比较

2.9 Klotho 蛋白及血Ca2+与妊娠结局及围产儿结局的相关性分析

对母血及脐血Klotho 蛋白浓度、血Ca浓度与妊娠结局进行相关性分析发现，母血Klotho 蛋白浓度与血压呈负相关，脐血Klotho 蛋白浓度与分娩孕周呈正相关，血Ca浓度与分娩孕周呈正相关，与血压、低白蛋白血症、及胸腹水的发生呈负相关，差异有统计学意义(＜0.05)，母血、脐血Klotho 蛋白浓度及血Ca浓度与其他妊娠结局无明显相关性。见表7，说明Klotho蛋白浓度及血Ca浓度与妊娠结局有一定的关系，对于不良妊娠结局的预测有一定的意义。

表7 Klotho蛋白及血Ca2+与妊娠结局的相关性分析(r/P)

对母血及脐血Klotho 蛋白浓度与围产儿结局进行相关性分析发现，脐血Klotho 蛋白浓度与胎龄呈正相关，与早产的发生呈负相关，血Ca与胎龄呈正相关，与胎儿生长受限及早产的发生呈负相关，差异有统计学意义(＜0.05)。见表8。

表8 Klotho蛋白及血Ca2+与围产儿结局的相关性分析(r/ρ)

Klotho 蛋白是一种高表达于肾脏与大脑的抗衰老蛋白，其参与心血管疾病、细胞凋亡、应激氧化失衡等多种疾病的发生与发展。大量研究中显示Klotho蛋白的低表达可能导致内皮细胞功能障碍、血管生成受损，类似于衰老的血管，从而加快动脉粥样硬化、高血压的发展。Klotho 蛋白参与血压调节及保护血管确切机制尚不明确，可能从以下几点降低血压从而发挥保护心血管系统：(1)Klotho 蛋白可促进机体产生一氧化氮，减缓血压升高，预防血管纤维化及血管内膜肥厚，通过血清NO 机制参与高血压的发生、发展；
(2)Klotho蛋白可减少过氧化氢所诱导的内皮细胞凋亡和衰老以增强血管内皮细胞活性；
(3)Klotho 蛋白通过抑制Wnt/βCatenin 途径参与调节多个肾素—血管紧张素系统基因，从而参与血压的调节。

目前，Klotho 蛋白在胎盘中的具体作用机制尚未明确，本研究发现，Klotho 蛋白主要定位于合胞滋养细胞及绒毛结缔组织间隙，在细胞滋养细胞中也有少量表达，这与Loichinger研究一致。Klotho 蛋白似乎是一个潜在的重度子痫前期标记物，具有较高的敏感性和特异性。由于子痫前期是一种胎盘源性疾病，而人Klotho蛋白可能通过与重度子痫前期相关的不同途径发挥作用。本实验中，研究发现Klotho 蛋白在试验组胎盘中表达低于对照组，这可能与Klotho 蛋白通过血管内皮细胞产生一氧化氮、抗氧化酶以及新生血管生成有关，从而对内皮功能障碍产生保护作用。

研究发现，重度子痫前期患者血管平滑肌细胞外钙离子内流可能是导致低血钙及平滑肌细胞痉挛性收缩的重要原因，在PE 的病理过程中起重要作用。Chen发现额外的钙处理阻止了由低钙引起的内皮细胞活化，钙治疗前可防止暴露于坏死滋养细胞碎片、IL-6 或子痫前期丝氨酸引起的内皮细胞活化。因此，对于Ca导致重度子痫前期发病机制的研究，有助于为SPE 的防治提供新的思路和靶点。

新的研究发现，尿钙排泄及磷的重吸收与Klotho 蛋白的降低有关。基础研究也表明，小鼠Klotho基因敲除后不仅寿命缩短，还出现有高磷高钙血症、血管及软组织钙化等一系列钙磷代谢紊乱症状，这说明Klotho 蛋白对血钙具有调节作用。Klotho 蛋白调节血钙的机制可能有：(1)Klotho 蛋白可以作为FGF-23 的共受体，通过FGF-23 依赖性的机制调控钙磷代谢；
(2)Klotho 蛋白可以通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路，抑制血管平滑肌细胞向骨样细胞转分化，抑制钙盐沉积；
(3)Klotho 蛋白通过调控小管上皮细胞钙通道(transient rec eptor potential vanilloid 5，TRPV5) 活性从而促进钙的重吸收，抑制钙排泄；
(4)Klotho 蛋白可调节内源性钙离子以调节缺血再灌注损伤诱导的钙超载，这可能与VEGF 及肾上皮细胞表面TRPV5 介导的细胞钙内流有关。

本研究中，试验组胎盘中Klotho 蛋白的表达高于对照组，脐血中Klotho 蛋白含量低于正常对照组，血Ca亦低于对照组，差异有统计学意义(＜0.05)。本研究发现脐血中Klotho 蛋白含量在ROC 曲线中的AUC 值为0.818，大于0.6，其灵敏度为100%，特异度为58.3%，对SPE 有一定的预测意义，而母血中Klotho 蛋白含量在ROC 曲线中的AUC 值为0.554，小于0.6，无明显诊断价值，血Ca预测SPE 的曲线下面积为0.663，当Ca＜2.09 mmol/L 时，其预测SPE 的灵敏度为87.4%，特异度为42.1%。

对母血及脐血Klotho 蛋白浓度、血Ca浓度与妊娠结局进行相关性分析发现，母血Klotho 蛋白浓度与血压呈负相关，脐血Klotho 蛋白浓度与分娩孕周呈正相关，对母血及脐血Klotho 蛋白浓度与围产儿结局进行相关性分析发现，脐血Klotho 蛋白浓度与胎龄呈正相关，与早产的发生呈负相关，血Ca与胎龄呈正相关，与胎儿生长受限及早产的发生呈负相关，差异有统计学意义(＜0.05)。SPE 孕妇胎盘中Klotho 蛋白的表达低于对照组，脐血中含量低于正常对照组，Klotho 蛋白与SPE 的发生有一定的关系。母血血Ca、脐血中Klotho蛋白浓度的降低是发生SPE 的高危因素，血Ca、母血及脐血中Klotho 蛋白浓度与妊娠结局及围产儿结局有一定的相关性，对SPE 的预测、诊断有一定的意义。

综上所述，Klotho 蛋白及Ca与重度子痫前期的发生有一定的关系，本研究为重度子痫前期的诊治提供了新的方向。但由于样本量及实验条件的限制，Klotho 蛋白调控重度子痫前期的确切分子机制未深入研究，有待进一步探索。