125I粒子联合AZD1152对三阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

张 月，王耀一，武雪亮，张志生，杨修明，姜 洋，乔志飞，梁晚平，薛 军

(河北北方学院附属第一医院乳腺外科，河北 张家口 075000)

乳腺癌已被证实是一种个体异质性肿瘤，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)生物学上更具有侵袭性，目前尚未发现有效的靶向治疗药物，内科治疗仍以化疗为主，可供选择的治疗药物有限，临床预后较差[1-2]。故TNBC 治疗研究的焦点逐渐集中在靶向药物，而多手段联合应用为TNBC 的治疗提供了良好的前景。

Aurora 激酶作为一个新的研究靶点，其相关抑制剂联合放疗已成为治疗TNBC的研究方向[2]。AZD1152为高选择性Aurora B抑制剂，已被证实可有效诱导急性骨髓淋巴细胞系凋亡[3]，但关于AZD1152抑制TNBC的研究较少，125I 放射性粒子治疗又称“粒子刀”，是将放射性粒子植入肿瘤内部，利用放射性核素衰变发射射线持续作用于肿瘤，导致DNA损伤，阻滞细胞于G2/M期，从而达到抑制肿瘤增殖的目的[4]。研究[5-6]表明125I放射性粒子可增加AZD1152对TNBC治疗的敏感性。因此，本研究旨在探索125I 放射性粒子联合AZD1152 处理对TNBC 细胞增殖和凋亡的影响，从而为TNBC新治疗方法的开展提供试验支持。

1.1 细胞系与主要试剂

MDA-MB-231细胞系由河北北方学院附属第一医院中心实验室传代保存。AZD1152由Selleck Chemicals公司惠赠(S1147)。RPMI-1640 培养液购自美国Gibco公司；
胎牛血清购自新西兰Hyclone 公司；
BCA 蛋白分析试剂盒购自美国Pierce 公司；
CCK-8 细胞增殖及毒性检测试剂盒购自北京索来宝公司(CA1210)；
磷酸化组蛋白H3(phosphorylated histone H3，p-Histone H3)、细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Bcl-XL、Bcl-2、腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosinediphosphateribose polymerase，PARP)、β-actin 一抗均购自美国Cell Signaling 公司。染料Hoechst 333342 购于美国Invitrogen 公 司(BLI894A-1)；
Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)试剂盒购自美国BD Pharmingen公司。

1.2 方 法

1.2.1 体外125I 粒子照射模型125I 粒子离体照射模型采用约3 mm 厚的聚苯乙烯板构成框架，设计为抽屉式方便放入及取出粒子，框架将细胞的培养皿/板作为上层，将粒子盘作为下层，14个4.5 mm×0.8 mm的粒子凹槽以等距离方式刻在以35 mm为直径(d)的圆形粒子盘上，保证粒子的位置稳定，细胞培养板放在照射模型上方，可放置活动度一致的粒子，让培养皿中心与粒子盘中心相对应，使12 mm为粒子盘距培养皿底部的距离(h)，即d/h为2.9，将其放于孵箱中，调整细胞密度为8×104个/孔，剂量为2.77 cGy/h，照射1 min，顺时针定期转动细胞培养皿保证均匀照射。

1.2.2 荧光染料显色观察细胞核的变化铺6 孔板，细胞数目为8×104个/孔，MDA-MB-231 细胞分为对照组(RPMI-1640 培养液)和1 μmol/L AZD1152 作用组，分别处理细胞24、48 h 后，PBS 冲洗，用Hoechst 33342(5 μg/mL)染色，因为Hoechst 33342 为DNA 特异性染料，可将细胞核染为蓝色，室温孵育30 min后在倒置荧光显微镜(莱卡，德国)下观察细胞核的变化。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖抑制率将MDA-MB-231细胞分为对照组(RPMI-1640培养液)、125I粒子照射组(照射组)、1 μmol/L AZD1152作用MDA-MB-231细胞48 h 组(抑制组)、125I 粒子照射与1 μmol/L AZD1152 联合作用MDA-MB-231 细胞48 h 组(联合组)，每组设置6个复孔，各组处理后加入四甲基噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，温箱孵育4 h后弃上清，加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)震荡10 min 溶解显色，用酶标仪检测吸光度值，计算细胞增殖抑制率。

1.2.4 CCK-8 法检测细胞活力将MDA-MB-231 细胞接种到96 孔板中，分组同1.2.3。每组分别孵育12、24、36、48 h，每孔添加10 μL 的CCK-8 试剂，37 ℃，孵育2～3 h，使用酶标仪(Thermo)检测波长460 nm处的光密度值。

1.2.5 细胞周期检测细胞分组同1.2.3，对照组和抑制组各设24、48 h 2个检测时间点。胰酶消化收集细胞，用7 mL PBS 洗涤，1 000 r/min 离心5 min，无水乙醇固定，继续离心将乙醇弃去，加入PI/RNase后，在流式细胞仪上分析，应用Multicycle 软件分析细胞倍数和周期。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡分组同1.2.3，收集细胞，PBS洗涤，分别加入Annexin V和PI(5 mg/L)各5 μL，混匀，室温避光孵育15 min 后，加入500 μL结合缓冲液，4 ℃静置30 min，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.2.7 Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达按1.2.3 处理MDA-MB-231 细胞后常规进行裂解、变性、蛋白定量、电泳、转膜。封闭后将膜转入p-Histone H3、Histone H3、Cyclin B1、Bcl-XL、Bcl-2 和PARP 一抗稀释(1∶1 000)液中，4 ℃冰箱摇床过夜，TBST洗膜，每次10 min，洗3次，室温羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜后ECL 发光，曝光[7]。应用ImageJ软件进行蛋白定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件分析数据，实验数据以表示，不同组间差异的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 AZD1152诱导MDA-MB-231细胞多核的形成

荧光染料显色观察对照组MDA-MB-231细胞系培养24 和48 h 后可见正常的核形态，未见多核细胞(图1A 和C)；
1 μmol/L AZD1152 作用24 h 可见正常的核分裂(图1B)，作用48 h 时可见到多核细胞(图1D 箭头所示)。

图1 荧光染色显示AZD1152诱导MDA-MB-231细胞多核形成

2.2 125I粒子联合AZD1152对细胞增殖的影响

MTT 检测结果见图2。对照组的抑制率为(0.61±0.32)%，与对照组比较，照射组、抑制组、联合组细胞的增殖抑制率分别为(17.62±1.41)%、(29.67±0.41)%、(53.17±1.26)%，均明显升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图2 125I粒子联合AZD1152对MDA-MB-231细胞抑制率的影响

2.3 125I粒子联合AZD1152对细胞存活率的影响

CCK-8检测结果见图3。孵育12、24、36和48 h时对照组的细胞存活率分别为(97.85±0.02)%、(96.75±0.21)%、(95.83±0.31)%、(94.88±0.22)%，照射组为(75.12±0.11)%、(68.09±0.21)%、(65.11±0.34)%、(59.21±0.14)%，抑制组为(65.33±0.31)%、(60.27±0.25)%、(59.03±0.31)%、(42.05±0.17)%，联合组为(56.15±0.28)%、(50.25±0.52)%、(43.17±0.44)%、(32.12±0.36)%，照射组、抑制组和联合组各时间点细胞存活率均较对照组明显降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，且在48 h作用最明显。

图3 125I粒子联合AZD1152对MDA-MB-231细胞存活率的影响

2.4 125I 粒子联合AZD1152 对细胞周期和DNA 倍体的影响

流式细胞术检测结果见图4。抑制组在48 h 时，在细胞周期G1 期、G2 期、S 期和M 期均出现了多倍体，或更高DNA 含量的细胞数目增加，形成明显的G2/M 期阻滞(图4D)，125I 粒子照射组较抑制组在24 h时G2/M 期阻滞升高，125I 粒子照射与1 μmol/L AZD1152联合作用48 h组易诱导发生多核、多倍体形成，出现G2/M 期阻滞最明显，最终发生凋亡(见表1，图4F)。

图4 125I粒子联合AZD1152对MDA-MB-231细胞DNA倍体的影响

表1 125I粒子联合AZD1152对MDA-MB-231细胞周期的影响

2.5 125I粒子联合AZD1152对细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示125I 粒子照射组、抑制组、联合组细胞的凋亡率分别为(17.48±0.24)%、(29.23±0.02)%、(63.11±0.27)%，与对照组的(0.31±0.03)%相比明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，可见125I 粒子照射与1 μmol/L AZD1152 联合作用组，细胞的凋亡率增加最显著(图5)。

图5 125I粒子联合AZD1152对MDA-MB-231细胞凋亡率的影响

2.6 125I 粒子联合AZD1152 对细胞p-Histone H3、Cyclin B1、Bcl-2、Bax、PARP的影响

Western blot 检测结果见图6。抑制组和联合组抗凋亡蛋白Bcl-2、组蛋白H3的磷酸化和Cyclin B1蛋白表达减少，而促凋亡蛋白Bax 和PARP 剪切体明显增强。125I 粒子联合AZD1152 对MDA-MB-231 细胞周期和凋亡蛋白表达的统计分析见图7。与对照组比较，联合组Bcl-2、磷酸化组蛋白H3和Cyclin B1蛋白表达水平明显减少(均为P<0.05)；
PARP 剪切体和Bax 蛋白的表达水平明显升高(均为P<0.05)，提示联合组可有效抑制磷酸化组蛋白H3 及Cyclin B1 的表达，促进MDA-MB-231细胞凋亡。

图6 Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达

图7 125I 粒子联合AZD1152 对MDA-MB-231 细胞周期和凋亡相关蛋白表达的统计分析

TNBC 作为恶性行为最高的一类乳腺癌，具有侵袭性强、易转移、易复发、分期晚及患者的预后差等特点，目前化疗仍然为TNBC 最主要的系统性治疗措施，因此如何进行个体化的精准治疗是当前研究的重点。此外针对TNBC的局部治疗(包括手术及放疗)亦不容忽视，局部放疗又包括体内照射和体外照射，放射线可破坏DNA 的完整性，使细胞发生细胞周期阻滞，进而促进细胞凋亡[5-6]。放射性核素125I粒子治疗属于体内照射，其通过破坏DNA 结构，导致细胞核遭到破坏，从而杀伤癌细胞。125I粒子半衰期较长可持续近距离杀伤肿瘤细胞[8]。125I 粒子照射在前列腺、肺癌、肝癌、胰腺癌、直肠癌和脊柱转移瘤等治疗中疗效显著[9-10]，但是关于乳腺癌的报道相对较少，单独的放射治疗不能成为乳腺癌治疗的唯一手段，新型小分子靶向治疗与放射联合成为治疗晚期乳腺癌的新方向。

Aurora 激酶作为潜在的乳腺癌治疗靶点，可参与细胞周期检查点而发挥作用。Aurora 激酶可控制中心体循环，调节染色体凝聚和协调，并影响纺锤体形成和胞质分裂，参与G2 向M 期过渡[11]。在有丝分裂期Aurora B 激酶可催化组蛋白起作用，组蛋白在细胞周期G2 晚期达到高峰，随着细胞周期进行，可扩展到染色体的各个部分，磷酸化组蛋白H3 持续存在于整个有丝分裂期过程中[12]。Cyclin B1是调控细胞增殖过程的周期蛋白，与组蛋白同时起作用，当细胞进入G1期，Cyclin B1 蛋白的表达较低，随着细胞周期的推进，到S 期和G2 期其表达逐渐升高，并与CDK1 形成有丝分裂促进因子(mitosis promoting factor，MPF)酶复合物，直到G2 晚期Cyclin B1 蛋白的表达达到峰值，一直持续到有丝分裂中末期[13-15]。

AZD1152 是Aurora 激酶的特异性抑制剂[3，16]，AZD1152 抑制磷酸化组蛋白H3，出现G2/M 期阻滞，使4倍体或更高DNA含量的细胞数量增加，多核细胞及多倍体细胞产生以及细胞凋亡增多。本研究显示1 μmol/L AZD1152 作用MDA-MB-231 细胞48 h 出现多核细胞和多倍体细胞，易发生细胞凋亡。在后续的研究中，将125I 粒子照射与1 μmol/L AZD1152 联合进行实验，发现联合组的细胞增殖抑制率为(53.17±1.26)%，细胞存活率为(32.12±0.36)%，G2/M期阻滞达到(75.52±0.45)%，且联合组中抗凋亡蛋白Bcl-2、磷酸化组蛋白及Cyclin B1 减少而促凋亡蛋白Bax、PARP剪切体增加明显，凋亡率为(63.11±0.27)%。

综上所述，125I 粒子对AZD1152 有增敏作用，125I联合Aurora激酶抑制剂AZD1152可抑制MDA-MB-231细胞组蛋白H3 磷酸化及Cyclin B1 水平，从而抑制细胞增殖，诱导凋亡，为晚期三阴性乳腺癌治疗提供了新思路。