HPLC-PDA联合Box-Behnken响应面法优选五苓散低极性部位提取工艺

王慧森，刘 明，李更生，梁瑞峰，葛文静，夏书梼

HPLC-PDA联合Box-Behnken响应面法优选五苓散低极性部位提取工艺

王慧森1，刘 明1，李更生1，梁瑞峰1，葛文静1，夏书梼2

1. 河南省中医药研究院，河南 郑州 450004 2. 郑州大学医药科学研究院，河南 郑州 450052

应用HPLC-PDA联合响应曲面法，筛选五苓散低极性部位乙醇提取最佳工艺。采用多波长切换定量测定，以23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、麦角甾醇、茯苓酸、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III、肉桂酸、桂皮醛9种有效成分为评价指标，采用Box-Behnken响应曲面法考察提取乙醇体积分数、料液比、提取时间对提取工艺的影响，确定最佳工艺。色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），体积流量为0.8 mL/min，柱温为40 ℃。流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～10 min，37%～60%乙腈；
10～20 min，60%乙腈；
20～23 min，60%～95%乙腈；
23～36 min，95%乙腈；
36～37 min，95%～37%乙腈；
37～42 min，37%乙腈。检测波长为280、247、220、208 nm多波长切换。最佳提取工艺为10倍量75%乙醇提取2次，每次1.5 h。建立的HPLC-PDA法稳定可行，适合多种成分同时测定。响应曲面法所建模型准确，可以较好地预测9种成分含量综合评分；
优选的提取工艺方法重现性良好，稳定可行，为五苓散临床应用、药效物质基础研究和新药开发提供技术参考。

五苓散；
提取工艺；
HPLC-PDA；
响应曲面法；
多指标综合评价；
23-乙酰泽泻醇B；
23-乙酰泽泻醇C；
麦角甾醇；
茯苓酸；
白术内酯I；
白术内酯II；
白术内酯III；
肉桂酸；
桂皮醛

五苓散（Wuling Powder）出自东汉末年名医张仲景的《伤寒论》，由泽泻、猪苓、茯苓、白术、桂枝5味药组成，为中药利水渗湿剂代表方；
具有利水渗湿、温阳化气的功效[1]；
可用于治疗膀胱蓄水证、水逆证和津亏液燥证[2]。现代临床应用和药理研究表明，五苓散对改善泌尿系统、神经系统、消化系统、心血管系统[3]、腹水[4]、骨质疏松[5]等疾病的临床症状、相关指标等有明显的优势和应用前景。医家张仲景临床遣方用药多以汤剂为主，但经临床疗效反复实践宜散不宜汤有其科学内涵。有文献报道[6]，对41例五苓方汤剂和散剂治疗水湿内停证患者的随机对照临床研究，结果显示五苓方散剂组的疗效显著优于汤剂组。该作者进一步对五苓方汤剂和散剂的化学成分进行比较研究发现，汤剂的一组非挥发低极性分子仅为其同方散剂1/450，可见低极性部位成分是该复方不可缺少的重要药效物质[7]。有关五苓散化学成分的报道目前多集中在各单味药材上，而对复方整体研究则较少。文献报道有检测五苓散复方中桂皮醛含量[8]，单味药材泽泻中23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C含量[8-10]，猪苓中麦角甾醇含量[8]，茯苓中茯苓酸含量[11-12]，白术中白术内酯I、II、III含量[13-14]，桂枝中桂皮醛、肉桂酸含量测定[15]等，未见五苓散HPLC多个成分同时测定的研究报道。本研究以五苓散中活性代表成分23-乙酰泽泻醇B[16-18]、23-乙酰泽泻醇C[17-19]、麦角甾醇[20]、茯苓酸[21-22]、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III[23-24]、桂皮醛[25]、肉桂酸[26]等为指标成分，建立稳定可行的多波长切换同时测定方中9种成分含量的HPLC-PDA方法。采用响应曲面法（response surface methodology）以多指标量化综合评分结合出膏率筛选五苓散乙醇提取最佳方案，为中药新药开发及药效物质基础研究提供技术参考。

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，2996 PDA检测器，美国Waters公司；
AUY120型万分之一电子天平，日本岛津公司；
AE240型十万分之一电子天平，瑞士梅特勒托利多公司；
UL UP-IV-10T超纯水器，四川优普；
SB-5200DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；
FW100型高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；
DZKW-2型电热恒温水浴锅，北京用光明医疗仪器厂；
DHG型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 试剂

对照品麦角甾醇（批号111845-201604）、23-乙酰泽泻醇B（批号111846-201504）、23-乙酰泽泻醇C（批号112062-202001）、白术内酯I（批号111975-201501）、白术内酯II（批号111976-201501）、白术内酯III（批号111978-201501）、肉桂酸（批号110788-201604）、桂皮醛（批号110710-202022），质量分数均≥98%，购自中国食品药品检定研究院；
对照品茯苓酸，批号Y15A7511814，质量分数≥98%，购自上海源叶生物科技有限公司；
乙腈、甲醇，色谱级，美国Fisher公司；
磷酸，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；
乙醇，分析纯，上海永大化学试剂有限公司；
水为超纯水。

1.3 药材

泽泻（批号20090104）、猪苓（批号20130101）、茯苓（批号20110102）、白术（批号20090201）、桂枝（批号20110201）饮片购自河南省郑州市瑞龙制药股份有限公司，经河南省中医药研究院李更生研究员鉴定，泽泻为泽泻科泽泻属植物泽泻-Linn.的干燥块茎、猪苓为多孔菌科多孔菌属真菌猪苓(Pers.) Fries的干燥菌核、茯苓为多孔菌科茯苓属真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核、白术为菊科苍术属植物白术Koidz.的干燥根茎、桂枝为樟科樟属植物肉桂Presl的干燥嫩枝经加工制成的饮片。

2.1 五苓散提取液中9种指标成分定量测定及综合评价指标确定

2.1.1 色谱条件色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），体积流量为0.8 mL/min，柱温为40 ℃。流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～10 min，37%～60%乙腈；
10～20 min，60%乙腈；
20～23 min，60%～95%乙腈；
23～36 min，95%乙腈；
36～37 min，95%～37%乙腈；
37～42 min，37%乙腈。检测波长为280 nm（测定麦角甾醇、白术内酯I、肉桂酸和桂皮醛）、247 nm（测定23-乙酰泽泻醇C）、220 nm（测定白术内酯II、白术内酯III）、208 nm（测定23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸）。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取干燥至恒定质量的23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、麦角甾醇、茯苓酸、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III、肉桂酸、桂皮醛对照品适量，加乙腈溶解定容，制成对照品母液。分别吸取对照品母液各0.5 mL加入超纯水定容至10 mL，混匀，制成含23-乙酰泽泻醇B 59.4 μg/mL、23-乙酰泽泻醇C 23.0 μg/mL、麦角甾醇20.3 μg/mL、茯苓酸50.2 μg/mL、白术内酯I 10.1 μg/mL、白术内酯II 14.4 μg/mL、白术内酯III 20.3 μg/mL、肉桂酸20.3 μg/mL、桂皮醛513.4 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 样品及供试品溶液的制备

（1）五苓散的制备：取五苓散处方各药味粉碎过80目筛，按处方比例（泽泻15 g、猪苓9 g、茯苓9 g、白术9 g、桂枝6 g）称取各药味细粉适量，均匀混合制成干燥粉末状制剂，备用。

（2）供试品溶液的制备：根据Box-Behnken设计原理，按照Design-Expert V8.0.6软件设计3因素3水平共17组试验方案回流提取，每组提取药液冷却至室温，分别混合均匀，滤过，低温（60 ℃以下）真空浓缩至适量，作为1～17号样品溶液，分别取样品溶液10 mL，蒸干，残渣用40%乙腈溶解，定容至10 mL，0.22 µm 微孔滤膜滤过，制得供试品溶液，备用。

（3）阴性对照样品溶液的制备：按照供试品溶液的制备方法，分别制备缺桂枝、缺白术、缺泽泻、缺茯苓、缺猪苓的阴性对照样品溶液。

2.1.4 方法学考察

（1）系统适应性试验和专属性试验：分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及各阴性对照样品溶液各10 µL，注入液相色谱仪，测定。结果表明23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、麦角甾醇、茯苓酸、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III、肉桂酸、桂皮醛的保留时间依次为24.364、10.339、36.010、24.986、14.340、11.496、8.035、3.357、4.578 min。样品和对照品对应峰最大吸收波长分别为麦角甾醇、白术内酯I、肉桂酸、桂皮醛为280 nm，23-乙酰泽泻醇C为247 nm，白术内酯II、白术内酯III为220 nm，23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸为208 nm。各对照品与供试品溶液中其他组分色谱峰分离度良好（＞1.5）。各阴性样品色谱图中未见所缺中药药味对照品。色谱图见图1。

1-肉桂酸 2-桂皮醛 3-白术内酯III 4-23-乙酰泽泻醇C 5-白术内酯II 6-白术内酯I 7-23-乙酰泽泻醇B 8-茯苓酸 9-麦角甾醇

（2）线性关系考察：将“2.1.2”项下各对照品配成系列混合对照品溶液，质量浓度分别为23-乙酰泽泻醇B 5.94、11.88、17.82、23.76、29.70、35.64 µg/mL；
23-乙酰泽泻醇C 2.3、4.6、6.9、9.2、11.5、13.8 µg/mL；
麦角甾醇2.028、4.056、6.084、8.112、10.140、12.168 µg/mL；
茯苓酸5.02、10.04、15.06、20.08、25.10、30.12 µg/mL；
白术内酯I 1.008、2.016、3.024、4.032、5.04、6.048 µg/mL；
白术内酯II 1.438、2.875、4.313、5.750、7.188、8.626 µg/mL；
白术内酯III 2.034、4.068、6.102、8.136、10.170、12.204 µg/mL；
肉桂酸2.03、4.06、6.09、8.12、10.15、12.18 µg/mL；
桂皮醛0.051 3、0.102 6、0.153 9、0.205 2、0.256 5、0.307 8 mg/mL。按“2.1.1”项下色谱条件各进样10 µL，测定各指标成分峰面积。将所得峰面积（）与各对照品的质量浓度（）进行线性回归，得回归方程、相关系数（）及线性范围分别为23-乙酰泽泻醇B＝1 106 808－24 587，＝0.999 0，线性范围5.94～35.64 µg/mL；
23-乙酰泽泻醇C＝1 873 745－23 870，＝0.999 1，线性范围2.3～13.8 µg/mL；
麦角甾醇＝1 142 505－16 276，＝0.999 2，线性范围2.028～12.168 µg/mL；
茯苓酸＝1 029 570－34 749，＝0.999 3，线性范围5.02～30.12 µg/mL；
白术内酯I＝6 268 197－11 847，＝0.999 2，线性范围1.008～6.048 µg/mL；
白术内酯II＝5 868 314－52 321，＝0.999 1，线性范围1.432～8.628 µg/mL；
白术内酯III＝3 378 531－37 521，＝0.999 3，线性范围2.034～12.204 µg/mL；
肉桂酸＝18 026 680－194 351，＝0.999 3，线性范围2.03～12.18 µg/mL；
桂皮醛＝7 673 681－702 666，＝0.999 2，线性范围51.34～308.04 µg/mL。

（3）精密度考察：取“2.1.2”项下混合对照品溶液及“2.1.3”项下3号供试品溶液分别重复进样6次，进行精密度试验，结果各成分在对照品溶液和供试品溶液中峰面积的RSD分别为23-乙酰泽泻醇B为2.49%及0.93%、23-乙酰泽泻醇C为2.34%及3.05%、麦角甾醇为1.53%及1.20%、茯苓酸为1.93%及0.56%、白术内酯I为0.79%及3.07%、白术内酯II为1.01%及3.08%、白术内酯III为0.67%及3.05%、肉桂酸为1.85%及2.74%、桂皮醛为1.92%及3.04%，结果可见精密度良好。

（4）稳定性考察：分别于0、2、4、6、12、24 h测定同一份供试品溶液（“2.1.3”项下3号供试品）稳定性，测得各成分峰面积，计算峰面积RSD分别为23-乙酰泽泻醇B 1.96%、23-乙酰泽泻醇C 1.65%、麦角甾醇1.16%、茯苓酸1.74%、白术内酯I 1.59%、白术内酯II 1.69%、白术内酯III 1.37%、肉桂酸0.90%、桂皮醛为1.57%，结果可见供试品溶液在24 h内稳定性良好。

（5）重复性考察：取同一样品（“2.1.3”项下3号样品）平行6份，依法制得供试品溶液。分别精密量取10 µL，按前述色谱条件进样，测定，分别计算各成分质量分数的RSD，结果23-乙酰泽泻醇B的RSD为1.72%，23-乙酰泽泻醇C的RSD为1.53%，麦角甾醇的RSD为1.12%，茯苓酸的RSD为1.78%，白术内酯I的RSD为1.13%，白术内酯II的RSD为1.87%、白术内酯III的RSD为1.69%、肉桂酸的RSD为1.82%、桂皮醛的RSD为1.88%，结果可见本测定方法重现性良好。

（6）加样回收率试验：精密量取“2.1.3”项下3号样品溶液平行6份，按各指标成分含量约1∶1精密加入对照品，按“2.1.1”项下色谱条件测定各指标成分的含量。计算回收率和RSD值。结果各指标成分回收率和RSD值分别为23-乙酰泽泻醇B 99.12%、1.81%；
23-乙酰泽泻醇C 102.05%、1.83%；
麦角甾醇99.88%、1.68%；
茯苓酸100.47%、1.65%，白术内酯I 100.28%、1.95%，白术内酯II 97.34%、1.32%，白术内酯III 101.32%、1.18%，肉桂酸97.21%、1.89%，桂皮醛99.51%、1.84%。

2.1.5 样品测定 精密吸取单因素及响应曲面试验样品溶液，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1.1”色谱条件进样测定。计算样品中23-乙酰泽泻醇B等9种成分含量。

2.1.6 五苓散中9种成分综合评分 采用多指标-响应曲面法进行综合评价，依据处方配伍君臣佐使及各药味成分药理活性进行各个指标成分权重分配，综合评分＝23-乙酰泽泻醇B得分×25%＋23-乙酰泽泻醇C得分×25%＋麦角甾醇得分×22.5%＋茯苓酸得分×22.5%＋白术内酯I得分×1%＋白术内酯II得分×1%＋白术内酯III得分×1%＋肉桂酸得分×1%＋桂皮醛得分×1%。指标成分得分＝该指标含量/该指标组最高含量。本实验单因素和响应曲面实验结果均以综合评分进行分析。

2.2 五苓散乙醇提取液出膏率的测定

精密吸取单因素或响应曲面试验样品溶液20 mL置于恒定质量蒸发皿中，水浴挥干，置于105 ℃烘箱干燥至恒定质量，放至室温迅速称定质量，计算出膏率。

2.3 影响五苓散醇提工艺的单因素考察试验

2.3.1 提取溶媒乙醇体积分数的考察 按处方比例称取五苓散各药味细粉共计48 g混匀，分别加入10倍量不同体积分数乙醇超声处理30 min，提取液滤过，取滤液按“2.1.1”项下色谱条件测定各指标成分的含量，考察乙醇体积分数对各指标成分影响。结果见表1。各成分提取量随乙醇体积分数提高而增大，55%～95%乙醇时9种成分均可以提出且综合评分具有较优值，考虑到提取过程的安全性，大量提取时乙醇体积分数不宜过高，故取55%、70%、85%乙醇质量分数3个点进行响应曲面实验。

2.3.2 提取时间的考察 按处方比例称取五苓散各药味细粉共计48 g混匀，取6份分别加入10倍量75%乙醇回流提取20、40、60、80、100、120 min，提取液放凉滤过，取滤液按“2.1.1”项下色谱条件测定各指标成分的含量，考察提取时间对各指标成分影响。结果见表2。各成分提取量随提取时间增加而增大，在40～120 min时9种成分均有较高提取量且综合评分具有较优值，故取40、80、120 min 3个点进行响应曲面实验。

表1 乙醇体积分数对各成分含量及综合评分的影响

Table 1 Effect of ethanol concentration the content of each component and comprehensive score

乙醇/%质量分数/(mg∙g−1)综合评分 桂皮醛白术内酯III23-乙酰泽泻醇C白术内酯II白术内酯I23-乙酰泽泻醇B茯苓酸麦角甾醇 150.8140.027 50.047 30.017 20.010 6−−−0.151 351.8300.037 20.079 40.060 60.018 10.2790.111−0.526 552.2990.044 50.087 20.083 40.023 00.3970.2310.0270.763 752.4520.080 80.088 60.083 10.033 90.4210.2420.2030.982 952.2300.063 80.073 00.083 80.031 30.4120.2460.2170.947

表2 提取时间对各成分含量及综合评分的影响

Table 2 Effect of extraction time on content of each component and comprehensive score

提取时间/min质量分数/(mg∙g−1)综合评分 桂皮醛白术内酯III23-乙酰泽泻醇C白术内酯II白术内酯I23-乙酰泽泻醇B茯苓酸麦角甾醇 201.990.1150.050 90.070 30.013 10.3120.2070.2550.797 402.250.1120.055 00.071 80.013 70.3370.2420.3300.883 602.270.1080.054 70.070 80.012 80.3130.2790.3390.875 802.750.1100.057 20.073 10.013 40.3360.3890.3880.975 1003.52 0.1200.057 50.073 80.014 40.3290.3700.3780.980 1201.94 0.1320.051 10.073 00.013 50.2710.3670.3660.881

2.3.3 提取溶媒液料比的选择 药材质地不同蓬松度和吸水率不同，很大程度影响药材提取时液料比的选择。经实验药粉加入定量75%乙醇浸泡1 h，考察吸水率约为220%。药材粉碎后蓬松度降低且考虑到大量提取后期浓缩，故响应面实验时选择液料比范围在6～12倍量，同时第1次提取时考虑吸水率多加入2倍量提取溶媒。

2.3.4 提取次数考察 按处方比例称取五苓散各药味共计48 g粉碎混匀，加入75%乙醇回流提取5次，第1次10倍量，其余8倍量，每次提取90 min。平行操作3份。每次提取液分别滤过，取滤液20 mL置于恒定质量蒸发皿中，水浴挥干乙醇，置于105 ℃烘箱干燥至恒定质量，放至室温迅速称定质量，考察不同提取次数干膏量，计算出膏率。结果提取液平均出膏率第1～5次分别为12.33%、2.06%、1.15%、0.50%、0.27%，可见提取液总出膏率16.31%，前2次提取液总出膏率14.39%占5次总提取量的近90%，故选择确定提取次数为2次。

2.4 响应曲面实验

2.4.1 响应面法试验设计与实验结果 结合上述单因素实验结果，以提取时间（1）、乙醇体积分数（2）、液料比（3）为3个考察因素，以23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、麦角甾醇、茯苓酸、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III、肉桂酸、桂皮醛9种成分质量分数的综合评分和出膏率为响应值，按处方比例称取五苓散各药味共计48 g粉碎混匀，平行制成17份试验样品，设计3因素3水平试验设计方案，根据Box-Behnken中心组合设计，经Design-Expert V8.0.6软件分析处理，设计3因素3水平17组试验，试验方案及结果见表3。

2.4.2 实验结果分析 应用Design-Expert.V8.0.6软件对五苓散乙醇提取工艺实验数据进行分析，结果如下：9种成分提出量的综合得分对1、2、3的2次多元回归模型方程为综合评分＝0.93＋0.0171＋0.0502＋0.0493＋6.200×10−312－0.01313－1.550×10−323－0.06412－0.07622－0.22032，回归模型方差分析结果见表4。五苓散乙醇提取工艺的回归模型＝40.66，＝0.001＜0.05，结果表明2次多元回归模型显著，模型系数2＝0.981 2，adj2＝0.957 1，变异系数（CV）＝3.78%，结果表明模型拟合良好；
失拟＝2.05，＝0.249 2＞0.05，模型失拟度不显著，结果表明模型选择合适，可用于五苓散乙醇提取工艺分析。1次项2、3对模型有显著影响，交互项均未有显著影响，2次项均有显著影响。

表3 五苓散乙醇提取响应曲面实验设计与结果

Table 3 Design and results of response surface test of Wuling Powder extracted by ethanol

序号X1/minX2/%X3/倍质量分数/(mg∙g−1)综合评分出膏率/% 肉桂酸桂皮醛白术内酯III23-乙酰泽泻醇C白术内酯II白术内酯I23-乙酰泽泻醇B茯苓酸麦角甾醇 1807090.042.250.050.070.100.040.511.610.260.899 415.91 21207060.031.470.040.050.060.020.361.130.180.640 015.30 3807090.042.150.070.070.100.040.551.860.260.947 515.98 41208590.041.840.050.060.080.030.501.650.230.842 915.79 51205590.042.130.030.070.070.030.471.590.100.730 615.45 612070120.031.730.040.050.090.030.421.350.210.726 915.73 7807090.042.120.070.070.090.040.541.760.250.919 415.87 8805560.031.460.040.060.060.020.391.070.040.542 215.55 9408590.042.090.070.060.100.040.561.470.210.836 614.81 10407060.031.430.080.050.120.050.210.850.180.542 314.38 118055120.031.620.030.050.050.010.411.360.110.627 815.27 12807090.042.150.080.070.090.040.531.800.250.923 415.75 13808560.031.470.050.050.060.030.381.140.180.646 315.44 14807090.042.120.060.080.090.030.551.730.270.959 715.92 158085120.031.690.030.060.050.020.391.430.210.725 715.77 16405590.042.080.050.070.090.040.511.620.080.749 114.55 174070120.031.750.060.050.070.030.401.510.150.680 314.67

表4 五苓散乙醇提取工艺回归模型方差分析结果

Table 4 Results of variance analysis of regression model of Wuling Powder extracted by ethanol

来源9种成分综合评分出膏率 平方和自由度离差平方和F值P值平方和自由度离差平方和F值P值 模型0.30090.03440.660＜0.000 14.21090.47035.490＜0.000 1 X12.180×10−312.180×10−32.6400.148 51.86011.860141.410＜0.000 1 X20.02010.02024.3900.001 70.12010.1209.3000.018 6 X30.01910.01922.9700.002 00.07410.0745.6300.049 5 X1X21.540×10−411.540×10−40.1900.679 41.600×10−311.600×10−30.1200.737 7 X1X36.530×10−416.530×10−40.7900.403 94.900×10−314.900×10−30.3700.561 2 X2X39.610×10−619.610×10−60.0120.917 20.09310.0937.0600.032 6 X120.01710.01720.9100.002 61.58011.580119.640＜0.000 1 X220.02410.02429.3800.001 00.06510.0654.9400.061 7 X320.20010.200242.760＜0.000 10.27010.27020.6700.002 6 残差5.790×10−378.270×10−4 0.09270.013 失拟项3.510×10−331.170×10−32.0500.249 20.06330.0212.8600.168 1 纯误差2.280×10−345.700×10−4 0.02947.330×10−3 总和0.31016 4.30016

出膏率对1、2、3的2次多元回归模型方程为：出膏率＝15.89＋0.481＋0.122＋0.0963＋0.02012＋0.03513－0.1523－0.6112－0.1222－0.2532，回归模型方差分析结果见表4。回归模型＝35.49，＝0.001＜0.05，表明2次多元回归模型显著，模型系数2＝0.978 6，adj2＝0.951 0，CV＝0.74%，结果表明模型拟合良好；
失拟＝2.86，＝0.168 1＞0.05，模型失拟度不显著，结果表明模型选择合适，可用于五苓散乙醇提取工艺分析。1次项均对模型有显著影响，交互项23有显著影响，2次项12、32对模型有显著影响。

由响应面3D和等高线图（图2、3）的倾斜度反应两者对响应值的影响，倾斜度越高表明两者交互作用越显著。从3D和等高线图的颜色变化也可以初步判定，变化趋势增加，其颜色也呈加深趋势。

图2 以综合得分考察X1、X2和X3的交互作用

图3 以出膏率考察X1、X2和X3的交互作用

因此，以综合得分为指标，提取时间、乙醇浓度和液料比在响应范围内，23-乙酰泽泻醇B等9种成分含量以最大值为响应值，最后得出五苓散醇提取工艺为75.03%乙醇9.32倍量提取2次，每次85.41 min，23-乙酰泽泻醇B等9种成分综合得分预测值为0.941 994；
以出膏率为指标，使提取时间、乙醇浓度和液料比在响应范围内，出膏率最大值为响应值，最后得出五苓散醇提取工艺条件为76.59%乙醇10.78倍量提取2次，每次92.07 min，出膏率预测值为16.022 6%。

综上，结合单因素实验与综合评分和出膏率考察结果，五苓散乙醇提取工艺条件为以75%乙醇10倍量提取2次，每次90 min。

2.4.3 验证实验 按处方比例称取五苓散各药味共计144 g粉碎混匀，根据优选出的最佳工艺平行制备五苓散提取液3份，分别按照上述实验条件进行分析检测，实验结果见表5。提取工艺验证结果平均综合评分为0.926 629、出膏率为15.495 8%与模型预测值（0.941 994、16.022 6%）相近，相对误差为1.63%、3.29%，结果表明建立的模型预测性良好，提取工艺稳定合理。

表5 工艺验证试验结果

Table5 Results of process verification test

序号质量分数/(mg∙g−1)综合评分出膏率/% 肉桂酸桂皮醛白术内酯III23-乙酰泽泻醇C白术内酯II白术内酯I23-乙酰泽泻醇B茯苓酸麦角甾醇 10.064 42.840.040 70.096 80.097 60.031 10.4332.400.3460.929 515.79 20.061 02.830.039 30.094 40.098 20.029 40.4262.420.3560.928 615.81 30.066 42.980.046 50.097 30.099 00.029 70.4492.270.3550.931 514.90

五苓散被认为是中医的“利尿剂”，既能祛除体内有形的水分潴留，也可消除无形之痰饮，临床应用于水肿、泌尿系统、关节病、眩晕、头痛、心血管系统、消化系统疾病等[27]。五苓散方中重用泽泻为君，利水渗湿；
臣以茯苓、猪苓助君药利水渗湿；
佐以白术补气健脾以运化水湿，又佐以桂枝温阳化气以助利水。中药复方是多种成分的集合体，按照中医君臣佐使配伍理论相互协调制约，以多成分调控多靶点，从而达到临床治疗效果。

《伤寒论》收载方剂共113首，绝大多数以汤剂应用，仅有五苓散、四逆散等10余首方以散剂使用。散剂复方宜散不宜汤是由于汤剂以水为媒介对低极性成分提取能力有限，导致低极性部位化学成分不能被充分提取。五苓方汤剂和散剂的化学成分比较研究发现，汤剂非挥发低极性分子仅为其同方散剂1/450，可见低极性部位成分是该复方不可缺少的重要药效物质[7]，故对五苓散低极性部位提取工艺的研究将为进一步新药开发及药效物质研究提供技术支持。

以泽泻中23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C，猪苓中麦角甾醇，茯苓中茯苓酸，白术中白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III，桂枝中肉桂酸、桂皮醛为指标成分，着重建立了多波长切换同时测定该9种有效成分的HPLC-PDA方法。实验筛选了多种型号规格层析柱，最终确定Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），填料细柱效高，柱温40 ℃，体积流量0.8 mL/min时柱压适中稳定，各成分达到良好分离。

在样品和对照品HPLC图谱中相同保留时间点，23-乙酰泽泻醇B和茯苓酸的最大吸收波长为208 nm，白术内酯II和白术内酯III的最大吸收波长为220 nm，23-乙酰泽泻醇C的最大吸收波长为247 nm，麦角甾醇、白术内酯I、肉桂酸和桂皮醛的最大吸收波长为280nm。PDA波长切换程序为：0～6 min，280 nm；
6.1～9 min，220 nm；
9.1～10.5 min，247 nm；
10.6～13.5 min，220 nm；
13.6～20 min，280 nm；
20.1～25.3 min，208 nm；
25.31～42 min，280 nm。

在药学提取工艺优化过程中，常需同时考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化。常用的均匀设计和正交试验设计方法在试验时精度不够，筛择的试验取值仅是接近最佳值而非精确的最佳点，不能考察各因素间的交互作用。响应曲面法（response surface methodology，RSM）[28]是一种新型的试验设计方法，以建立连续变量曲面模型对影响工艺过程的因子及其交互作用进行评价，可以确定精确的最佳试验点，具有试验次数少、精度高等特点，在医药学领域应用比较成熟[29]。本实验针对乙醇提取工艺的影响因素，应用响应曲面法展开工艺考察研究。

响应曲面法试验中以各成分来源药味在复方中君臣佐使的配伍关系分配权重系数，君药泽泻中的成分23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C权重各占25%，臣药猪苓中成分麦角甾醇和茯苓中成分茯苓酸权重各占22.5%，佐使药白术中3种成分共占3%，桂枝中2种成分共占2%。以该9种有效成分含量的综合评分为指标进行考察更好体现评价的合理性，所建立的工艺稳定可行，响应模型拟合度良好，达到工艺优化的目的。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Optimization of low polarity components extraction process of Wuling Powder by HPLC-PDA combined with Box-Behnkenresponse surface methodology

WANG Hui-sen1, LIU Ming1, LI Geng-sheng1, LIANG Rui-feng1, GE Wen-jing1, XIA Shu-chou2

1. Henan Academy of Chinese Medicine, Zhengzhou 450004, China 2. Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou University,Zhengzhou 450052, China

The optimal ethanol extraction process for the low polarity components of Wuling Powder (五苓散) was established using HPLC-PDA combined response surface method.The quantitative analysis method of HPLC-PDA multi-wavelength switching was used to analyze the contents of nine active components including 23-acetate alisol B, 23-acetate alisol C, ergosterol, pachymic acid, atractylenolide Ⅰ, atractylenolide Ⅱ, atractylenolide Ⅲ, cinnamic acid and cinnamaldehyde. Box-Behnken response surface methodology was used to investigate the effects of extraction ethanol volume fraction, solid-liquid ratio and extraction time on Wuling Powder low polarity components extraction process to determine the optimal extraction process.The determination was performed on an Agilent Proshell 120 EC-C18column (100 mm × 4.6 mm, 2.7 μm) with a volume flow rate of 0.8 mL/min and a column temperature of 40 ℃. The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution: 0—10 min, 37%—60% acetonitrile; 10—20 min, 60% acetonitrile; 20—23 min, 60%—95% acetonitrile; 23—36 min, 95% acetonitrile; 36—37 min, 95%—37% acetonitrile; 37—42 min, 37% acetonitrile. The detection wavelength was multi-wavelength switched for 280, 247, 220, 208 nm.The established HPLC-PDA method is stable and suitable to analyze multiple components. The model established by response surface method is accurate and can be used to predict the comprehensive score of nine components well. The optimized extraction method had good reproducibility, stability and feasibility, which provided technical reference for clinical application, research of effective substances and development of new medicine of Wuling Powder.

Wuling Powder; extraction process; HPLC-PDA; response surface methodology; multiple indicators comprehensive evaluation; 23-acetate alisol B; 23-acetate alisol C; ergosterol; pachymic acid; atractylenolide Ⅰ; atractylenolide Ⅱ; atractylenolide Ⅲ; cinnamic acid; cinnamaldehyde

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6741 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.011

2022-05-22

河南省中医药科学研究专项重点课题（2018ZY1021）；
河南省中医药科学研究专项重点课题（2019ZY1041）

王慧森，女，副研究员，主要从事中药药效物质基础及中药新药开发研究。Tel:(0371)66331718 E-mail: whs_zz@126.com

[责任编辑 郑礼胜]