多粘菌素外排转运蛋白的研究进展

俄文慧，王文龙*，周春燕，杜秉海，刘凯，汪城墙

(1.山东农业大学生命科学学院/山东省盐碱地植物-微生物联合修复工程技术研究中心/山东省农业微生物重点实验室，山东 泰安 271018；
2.山东农业大学动物科技学院(动物医学院)，山东 泰安 271018)

随着生活环境的复杂化，人类传染性细菌和真菌疾病种类逐渐增多，一般的抗生素已满足不了需求，多粘菌素被认为是治疗耐多药革兰氏阴性细菌感染的最后一道防线[1]，其对几乎所有致病性革兰氏阴性菌具有治疗作用。1947年，在多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)[2]中首次发现了多粘菌素，其是一类环状脂肽类抗生素，对细菌细胞膜极具破坏力，具有优良的杀菌活性。

多粘菌素的产生菌多粘类芽孢杆菌是植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)[3]中的重要成员，广泛存在于土壤生境和植物根部，可通过产生多粘菌素对植物的细菌病原菌起到拮抗作用[4]。多粘菌素被多粘类芽孢杆菌合成后，需要借助于外排转运蛋白转运到胞外发挥拮抗功能。多粘菌素外排转运蛋白在一些多重耐药细菌(MDR)中也广泛存在。随着临床中抗生素的大量使用，一些病原菌也逐渐对多粘菌素等抗生素产生耐药性，如铜绿假单胞菌[5]、鲍曼不动杆菌[6]、肺炎链球菌等，其中的耐药机制之一就是多粘菌素外排转运蛋白的存在[7]。本文对目前鉴定的多粘菌素外排转运蛋白的类型、结构和转运特征等进行介绍。

多粘菌素的结构特征与其跨膜分泌紧密相联。多粘菌素的基本结构是一个十肽序列，包括一个七肽环、一个三肽侧链和脂肪酸链(图1)，第10位的氨基酸L-Thr和第4位的2，4-二氨基丁酸(L-Dab)环化形成一个七肽环，不同的氨基酸残基形成不同的多粘菌素类型[8]。多粘菌素B和多粘菌素E由于毒性小，抗菌活力强，已被应用于临床[9]。多粘菌素由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)合成[10]，NRPS是具有模块化结构的多酶复合物，直接将一种或多种特定氨基酸合成最终产物[11]。多粘菌素合成基因簇由5个开放阅读框组成:pmxA、pmxB、pmxC、pmxD和pmxE，其中，pmxA、pmxB和pmxE编码多粘菌素的NRPS，而pmxC和pmxD编码多粘菌素外排转运蛋白[12]。

图1 多粘菌素B和E的化学结构[7]

多粘菌素由多粘类芽孢杆菌合成和分泌，但目前对其跨膜分泌机制尚不明确，只鉴定出了两个多粘菌素高活性外排相关转运蛋白PmxC和PmxD[13]。本课题组前期研究显示[14]，在多粘类芽孢杆菌中有多种膜蛋白和多粘菌素的分泌有相关性，需要进一步挖掘和鉴定其多粘菌素外排谱。

MDR的耐药机制集中在改变或减少脂多糖的净负电荷[15]，减少孔蛋白途径，形成囊泡和过度囊泡，以及增加多粘菌素等药物外排[1]。多粘菌素虽然是治疗多重耐药菌的最后一道防线，但一些MDR也会出现对多粘菌素的耐药性。多粘菌素外排过程主要由膜外排转运蛋白起作用。目前，在一些MDR中鉴定出了不同类型的多粘菌素外排转运蛋白，主要涉及5种类型:耐药结节细胞分裂家族(RND)、ATP结合盒家族(ABC)、主要促进因子家族(MFS)、多药和有毒化合物输出家族(MATE)及小多药耐药家族(SMR)[16]。

2.1 多粘菌素RND外排系统

2.1.1 RND型外排系统结构 RND外排系统一般存在于革兰氏阴性MDR，由内膜转运蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白组成三联复合体，底物通过双层细胞膜直接排出。RND型家族外排转运蛋白由12个跨膜螺旋结构域(TMs)组成，在TM1和TM2以及TM7和TM8之间有两个大的胞外环，跨膜区的4个高度保守的带正电荷氨基酸残基是参与底物结合与转运的重要位点[17]。一些RND外排泵前后还存在阻遏蛋白，如smeR、cmeR等可控制外排转运蛋白的表达量。

2.1.2 多粘菌素RND家族外排系统的研究 目前已鉴定的与多粘菌素外排相关的RND外排系统见表1。

表1 多粘菌素RND家族外排系统

在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌都普遍存在的AcrAB-TolC是RND外排泵的典型代表(图2)。AcrAB-TolC由膜融合蛋白AcrA、外排转运蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC组成。在肺炎克雷伯菌中敲除acrB基因，菌株对多粘菌素的敏感性增强，抗菌肽减少[18，19]。AcrB横跨内膜，TolC横跨外膜，AcrA包围缠绕AcrB与TolC的外周胞质部分。多粘菌素等药物一般是从AcrAB-TolC中央孔道直接排出[20]。AcrA的N端脂质部分锚定在内膜上[21]。AcrA有一个原核脂蛋白信号肽，在其成熟序列的N端和C端各有1个疏水区，脂质化的N端镶嵌在内膜上，C端伸展到周质。膜融合中，AcrA起着连接作用，AcrA的C端与AcrB相互关联，而AcrA的N端在C端的协助下与TolC相互作用，AcrA能把AcrB和TolC联系起来[20]。AcrB主要作用是摄取和转运多粘菌素等底物，三个AcrB形成同型三聚体，横跨细胞内膜，由外周胞质部分和跨膜部分组成。AcrB带有12个TMs，在每个跨膜结构域中存在伪双重对称轴，即六个N末端螺旋与六个C末端螺旋对称排列。跨膜区域包含三个功能上必需的带电残基:Asp407、Asp480和Lys940。AcrB带有2个大的外周胞质发夹环，是其底物特异性的主要决定因子[22]。RND家族中的许多外排转运蛋白都与TolC类型蛋白相连。TolC位于外排泵AcrABTolC的最外侧，由跨膜部分和外周胞质部分组成。跨膜部分含12个β折叠，穿越外膜，向胞外开放，内径为底物排出提供宽阔通道；
外周胞质部分通过α螺旋卷曲可以开启、关闭外膜通道入口[23]。

图2 RND型外排系统AcrAB-TolC的模式图[22]

除了多粘菌素外排泵AcrAB-TolC外，在其他细菌中也发现了不同的RND家族多粘菌素外排转运蛋白。来自脆弱拟杆菌的外排泵BmeABC也与多粘菌素外排有关[24]。其中，BmeB是具有16个TMs的外排转运蛋白，BmeB也具有类似AcrB的三级结构[25]，BmeABC外排泵在残基1 500和2 140之间还具有一段特殊的保守氨基酸序列。

在空肠弯曲杆菌中的CmeABC和CmeDEF外排系统可介导抗生素耐药和维持细胞活力。CmeDEF外排泵在空肠弯曲杆菌中主要辅助CmeABC的外排。这两个外排泵参与了空肠弯曲杆菌细胞活力的维持。CmeABC与其他革兰氏阴性细菌中已知的多药外排泵具有结构同源性，其由周质融合蛋白CmeA、内膜转运蛋白CmeB以及外膜蛋白CmeC组成[26]。CmeB有12个TMs，在TM1和TM2、TM7和TM8之间有两个大环结构[27]。对两种空肠弯曲杆菌NCTC 11168和81-176进行试验结果显示，菌株11168 CmeF突变后相比野生菌株对多粘菌素的抗性降低了2倍，菌株81-176进行CmeE、CmeF双突变和CmeE单突变后相比野生菌株对多粘菌素敏感性增加了2倍[28]。在CmeABC上游有一个开放阅读框(ORF)，被命名为CmeR，其可以调控CmeABC的外排[29]，而CmeDEF不受CmeR的调控。

鲍曼不动杆菌的两个外排泵AdeABC和AdeFGH与多粘菌素外排紧密相关。Verma等[30]研究显示，外排泵AdeABC与多粘菌素的结合亲和力最强。Sato等[31]证明，在多粘菌素B存在下，编码外排转运蛋白的adeB基因转录水平与外膜蛋白A(ompA)以及生物膜相关蛋白(bap)的mRNA表达水平正相关。AdeR和AdeS共同响应刺激从而调节AdeABC的表达[32]。Sato等[31]也证明，adeG的表达水平与多粘菌素的存在与否呈正相关；
adeFGH基因的表达受LysR型转录调节因子(LTTR)的调控[33]。

铜绿假单胞菌可通过外排泵MexAB-OprM和MexXY-OprM外排多粘菌素[34]。外排泵Mex-AB-OprM中的MexB是外膜转运蛋白，形成不对称同源三聚体，其中每个单体均表现出由12个TM(TM1～TM12)组成的复杂拓扑结构，以及由TM1和TM2之间以及TM7和TM8之间的两个长环形成的宽周质结构域，这些周质结构域折叠成六个亚结构域，存在保守带电残基Asp407、Asp408和Lys939[34]。外排泵MexXY-OprM中的MexY作为转运蛋白，底物特异性几乎完全由其周质结构域决定。MexB和MexY转运蛋白利用质子动力将多粘菌素等药物输出到外部介质[35]。Morita等[36]在研究外排泵MexXY-OprM时，发现在其上游的一个调控基因ParRS会影响MexXY外排泵基因的表达，并赋予对多粘菌素的抗性。

VexAB-TolC外排泵可外排多粘菌素等抗生素并赋予霍乱弧菌抗药性。Bina等[37]在霍乱弧菌中突变VexAB，结果表明突变菌株对多粘菌素B的最低抑菌浓度(MIC)降低，外排泵VexAB将多粘菌素B作为底物。TetR家族转录调节因子VexR位于编码膜融合蛋白VexA上游，起调控VexAB的作用[38]。

Eda等[39]在苜蓿根瘤菌中发现，外排泵Sme-AB-TolC中的TolC基因突变后，相较于野生菌株，突变株对多粘菌素B敏感性增强，并且推测基因smeAB的表达由SmeR与SmeAB中反向序列的结合所介导。

对嗜麦芽窄食单胞菌外排泵SmeYZ的研究发现，PhoP可调节SmeZ的表达，敲除PhoP的菌株与野生菌株相比，SmeZ表达量显著降低，且对多粘菌素B的MIC降低，回补PhoP后，SmeZ表达量恢复到野生型水平，且对多粘菌素B的MIC恢复到野生型水平[40]。

脑膜炎双球菌可以抵抗阳离子抗菌多肽，外排泵MtrCDE对多粘菌素B存在特有的抗性[24]。MtrD外排转运蛋白嵌入内膜，并将药物从周质和内膜输出到MtrE外膜通道。MtrD包含底物结合位点，并通过H+反向转运机制传导药物输出所需的电化学能[41]。2014年，Bolla等[42]解析MtrD多药外排泵的晶体结构，每个MtrD的N端(TM1～TM6)和C端(TM7～TM12)存在伪对称关系。

伯克霍尔德氏菌的外排泵AmrAB-OprA和BpeAB-OprB参与多粘菌素的外排，AmrAB-OprA的amrB基因或BpeAB-OprB的bpeB基因突变会减少菌株对多粘菌素的外排，而超表达两个基因则能增强菌株对多粘菌素等抗生素的抗菌活性[43]。

2.2 多粘菌素ABC家族外排转运蛋白

2.2.1 ABC型外排转运蛋白的结构基础 ABC型外排转运蛋白的基本结构由两个跨膜结构域(TMDs)和两个核苷酸结合结构域(NBDs)组成，TMD提供底物转运通道，NBD水解ATP提供能量[44]。在细菌中，ABC型外排转运蛋白的单个TMD一般拥有6个跨膜螺旋(TM)，通常以同型或异型二聚体形式存在[45]。

2.2.2 多粘菌素ABC型外排转运蛋白的研究目前，在革兰氏阳性细菌中鉴定出两个多粘菌素ABC型外排转运蛋白(AbcAB和PmxCD)。AbcA和AbcB为异型二聚体ABC型多药转运蛋白，Margolles等[46]通过将短双歧杆菌AbcAB异源表达到乳酸乳球菌中，经过微生物药物敏感性测试，发现AbcAB提高了乳酸乳球菌对多粘菌素B的抗性。在对多粘类芽孢杆菌外排多粘菌素转运蛋白的研究中，Choi等[13]推测PmxC和PmxD可外排多粘菌素，Shaheen等[12]进一步通过单独敲除PmxC或PmxD，和共同敲除PmxC和PmxD，在单突变体以及双突变体中都观察到多粘菌素产量显著减少。本课题组在多粘类芽孢杆菌SC2-M1中敲除PmxC和PmxD也得到了与Shaheen等[12]相似的结果，进一步证明了PmxC和PmxD外排多粘菌素的功能。

在革兰氏阴性菌中也解析出了多粘菌素ABC外排转运蛋白。其中，MacABCsm外排转运蛋白由MacAsm、MacBsm和MacCsm形成三元操纵子，可外排多粘菌素，并有助于菌株的氧化和包膜应力耐受性以及生物膜形成。Lin等[47]在嗜麦芽窄食单胞菌中构建MacABsm突变体ΔMacAB，与野生型菌株相比，突变菌株显著降低了对多粘菌素B和多粘菌素E的MIC。Crow等[48]研究表明MacAB-TolC的表达增加了大肠杆菌对多粘菌素和杆菌肽的抵抗力，MacB蛋白通过协调其NBD的可逆二聚化与周质构象变化来转运底物(图3)。在大肠杆菌中MacB为二聚体，每个MacB单体均包含一个N端NBD、四个跨膜α-螺旋(TMH)、以及TMH1和TMH2之间的周质结构域。TMH3和TMH4堆积在螺旋束的外部，由一个短的胞质外环连接[45]，这是ABC型转运蛋白的典型结构[49]。

图3 ABC型外排转运蛋白MacAB-TolC的模式图[45]

2.3 多粘菌素MFS家族外排转运蛋白及其研究

MFS家族的外排转运蛋白通常含有12～14个TMs，通过膜融合蛋白与外膜蛋白组成三联复合体，将有毒化合物排出[50]。在肺炎克雷伯菌中敲除KpnGH基因及回补，证实KpnGH影响肺炎克雷伯菌的生长和生物膜形成能力，药敏试验结果表明，KpnGH基因敲除菌株比野生菌株对多粘菌素敏感性降低。KpnG有两个疏水跨膜区，跨越氨基酸23～45和55～77；
KpnF有13个跨膜区，跨越氨基酸16～38、52～73、76～98、106～128、138～160等[51]。

鲍曼不动杆菌中的外排泵EmrAB-TolC对多粘菌素E具有耐药性。在Lin等[52]的试验中，将A1S_1772和A1S_1773作为EmrAB系统的代表，分别命名为EmrB和EmrA，敲除鲍曼不动杆菌中EmrB基因，相较于野生菌株，敲除菌株对多粘菌素敏感性增加，并且通过荧光定量PCR试验证明经过多粘菌素E处理的菌株和野生菌株相比，A1S_1772和A1S_1773上调1.3～1.6倍，EmrAB泵系统与鲍曼不动杆菌中的多粘菌素E外排相关。鲍曼不动杆菌的EmrB是编码490个氨基酸的外膜转运蛋白，EmrA具有较大的可溶性C末端结构域(图4)。EmrAB复合物的电子显微镜单颗粒分析显示，存在约240×140Å的粒子结构，对应于两个背对背排列的EmrAB二聚体[53]。

图4 MFS家族外排转运蛋白EmrAB-TolC的模式图[45]

2.4 多粘菌素MATE家族外排转运蛋白及其研究

来自于越南伯克霍尔德菌的NorM蛋白(图5)是MATE家族的典型代表，NorM转运蛋白有12个TMs。由TM1～TM6和TM7～TM12构成的两束6跨膜螺旋形成一个空腔。胞质环将两个部分相连[54]。越南伯克霍尔德菌野生菌对多粘菌素不敏感，通过对NorM蛋白编码基因的敲除和回补试验，证实NorM蛋白与伯克霍尔德菌对多粘菌素B的敏感性正相关[55]。

图5 MATE家族外排转运蛋白NorM的模式图[56]

2.5 多粘菌素SMR家族外排转运蛋白及其研究

SMR家族外排转运蛋白单体一般含有4个跨膜α-螺旋结构，以二聚体形式通过构象变化泵出多粘菌素等药物[56]。Srinivasan等[57]在肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中突变SMR家族外排泵KpnEF的基因，突变菌株相比野生菌株对多粘菌素E敏感性增加，证明外排泵KpnEF与肺炎克雷伯菌对多粘菌素的外排功能有关。EbrAB为KpnEF的同源蛋白，图6为EbrAB模式图，可推知KpnEF的结构。

图6 SMR家族外排转运蛋白EbrAB的模式图[58]

多粘菌素相关外排转运蛋白目前主要来源于产多粘菌素的多粘类芽孢杆菌以及MDR，如鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等。目前MDR的多粘菌素耐药机制是研究热点，其中，多粘菌素外排蛋白起到重要作用。部分多粘菌素外排转运蛋白的晶体结构已经被解析，可深入探究其外排机制。而对于产多粘菌素的多粘类芽孢杆菌中的多粘菌素外排转运蛋白的研究不充分，目前仅通过间接试验证实PmxC和PmxD与多粘菌素的外排过程相关，因此对于多粘类芽孢杆菌中其他潜在的多粘菌素外排转运蛋白的发掘以及转运机制的解析是十分必要的。

根据序列相似性，多粘菌素外排转运蛋白可分为5种类型，其中RND家族中与多粘菌素外排相关的转运蛋白较多，主要存在于MDR中。揭示MDR菌株中的多粘菌素外排转运蛋白有助于研究和解决病原菌耐药性难题。总结多粘菌素相关外排转运蛋白及其特性，可为深入研究外排转运蛋白介导的细菌多重耐药性提供参考，也为进一步提高多粘类芽孢杆菌的多粘菌素产量提供理论依据。