胃癌并发Hp感染患者血清miR-101，HSP-70，IL-1β表达水平与肿瘤增殖和侵袭力的相关性研究

王 允，申重阳，韩建军，贾 利，高 飞，何 君，闵燕梅

(1.绵阳市第三人民医院/四川省精神卫生中心肿瘤内科，四川绵阳 621000；
2.成都中医药大学基础医学院，成都 610041)

胃癌为全球发病率第四的恶性肿瘤，居恶性肿瘤病死原因第二位，胃癌晚期患者5年生存率仅20%～25%，预后差[1-2]。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）被认为是胃癌的最主要危险因素，研究报道，约69%胃癌患者伴Hp 感染，且Hp 感染可能会促进胃癌发病及进展，但具体机制尚未明确[3]。研究报道，Hp 感染可造成胃黏膜炎症与癌前病变，导致胃癌发生、进展[4]。白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）可参与组织破坏及慢性炎症，属驱动癌症炎症细胞因子[5]。热休克蛋白-70（heat shock protein-70，HSP-70）可参与自身免疫性损伤及机体炎症过程，影响癌细胞浸润、黏附能力，促进恶性肿瘤发生、进展[6]。miRNA 于肿瘤中可发挥类似抑癌基因与致癌基因作用。本研究拟通过分析胃癌并发Hp感染患者血清miR-101，HSP-70和IL-1β表达水平与肿瘤增殖和侵袭力的相关性，初步探究Hp促进胃癌进展的机制，为胃癌诊疗提供一定参考。

1.1 研究对象 选取2017年2月～2020年2月绵阳市第三人民医院胃癌患者120 例为观察组（依据Hp 检测结果分为胃癌Hp 阳性组68 例、胃癌Hp 阴性组52 例），同期慢性胃炎患者86 例为对照组。纳入标准：①胃癌Hp 阳性组、胃癌Hp 阴性组均符合《中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见》[7]中胃癌有关诊断标准，且经组织病理学检查证实，既往无免疫治疗与放化疗史；
②对照组均符合《中国慢性胃炎诊治共识意见》[8]中慢性胃炎诊断标准，近两个月未采取系统治疗；
③各组均未采取抗Hp 治疗，知晓本研究，签订知情同意书。排除标准：①并发严重肝肾疾病；
②急性心肌梗死；
③并发脑梗死、颅脑损伤等严重脑血管疾病；
④并发精神系统疾病；
⑤并发胃底食管静脉曲张、肠梗阻、肠穿孔；
⑥并发其他部位恶性肿瘤；
⑦近期曾应用激素、非甾体类抗生素治疗。其中胃癌Hp 阳性组男性36 例，女性32 例，年龄54～76岁，平均年龄62.72±7.09 岁；
体质量指数（BMI）16～28 kg/m2，平均BMI 22.79±2.07kg/m2；
TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期42 例，Ⅲ～Ⅳ期26 例，并发症：糖尿病16 例，高脂血症19 例，高血压24 例。胃癌Hp 阴性组男性30 例，女性22 例，年龄53～79岁，平均年龄63.68±6.14 岁；
BMI 17～28 kg/m2，平均BMI 23.05±2.46kg/m2；
TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例，Ⅲ～Ⅳ期23 例，并发症：糖尿病10 例，高脂血症12 例，高血压16 例。对照组男性47 例，女性39 例，年龄51～78 岁，平均年龄61.75±7.36 岁；
BMI 16～27 kg/m2，平均 BMI 22.42±2.18kg/m2；
并发症：糖尿病18 例，高脂血症21 例，高血压27 例。各组年龄、性别、BMI，并发症等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 Megafuge2.0R 高速离心机购于德国Heraeus 公司；
MDF382 型超低温冰箱购于日本SANYO 公司；
MK3 型酶标仪购于芬兰雷柏公司；
7500 型实时荧光定量PCR 仪购于美国ABI 公司；
GVE-2100 型电子胃镜购于上海涵飞医疗器械有限公司；
HUBT-20P 型Hp 检测仪购于上海三崴医疗设备有限公司。酶联免疫吸附法试剂盒购于南京建成生物工程研究所。miR-101，肿瘤增殖、侵袭基因检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血清指标检测方法：入院后采集患者清晨空腹静脉血6 ml，以酶联免疫吸附法测定血清HSP-70，IL-1β水平；
提取总RNA，鉴定RNA 纯度与质量浓度，以实时荧光定量PCR 法测定血清miR-101 相对表达量，结果以2-△△Ct表示，操作严格按仪器与试剂盒说明书执行。

1.3.2 Hp 感染测定方法：①胃镜检查：于胃镜下取胃黏膜组织，应用甲醛溶液（浓度10%）固定，石蜡包埋，做连续切片，采取Giemsa 法染色，1 000倍显微镜下进行观察，若切片组织染色为紫红色则判定为Hp 阳性。②碳14 尿素呼气试验：于空腹下进行试验，口服碳14 尿素胶囊，15 min 后，嘱患者向呼气卡呼气约3 min，而后将呼气卡插入至Hp检测仪，进行自动检测，记录Hp 感染U 值，若测定Hp 感染U 值≥100 dpm/mmol 则判定为阳性。结合胃镜检查与碳14 尿素呼气试验结果，若两项结果均为阳性则判断为Hp 感染[9]。

1.3.3 胃癌组织中肿瘤增殖、侵袭基因测定方法：手术切除胃癌患者病灶后，取适量胃癌组织，以液氮冻存30 min 后置于-80 ℃冰箱中储存；
以RNA提取试剂盒将组织中总RNA分离，而后以cDNA第一链合成试剂盒反转录总RNA 为cDNA；
采取cDNA 样本稀释（比例为1∶5），以实时荧光定量PCR 法测定胃癌组织中肿瘤增殖基因[磷脂酰肌醇-3 激酶催化亚基δ（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit δ，PIK3CD），C-myc癌基因（C-myc oncogene，C-myc），zeste 基因增强子同源物2（zeste gene enhancer homolog 2，EZH2）]，侵袭基因[泛素样含PHD和环指域1（ubiquitin-like containing PHD and ring finger domain 1，UHRF1），Vav3 癌基因（Vav3 oncogene，Vav3）]的mRNA表达量。

1.3.4 随访至2021年2月探讨血清miR-101，HSP-70，IL-1β 对胃癌并发Hp感染患者生存率的影响。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0 软件进行统计分析，计数资料以率（%）描述，行χ2检验；
计量资料以均数±标准差(±s)描述，多组间比较采取单因素方差分析，进一步两两组间比较行SNK-q检验，两组间比较行独立样本t检验；
Hp 感染与胃癌患者血清各指标的关系采用Pearson 相关分析；
胃癌并发Hp感染患者血清各指标与胃癌组织中肿瘤增殖、侵袭基因关系应用Spearman 相关性分析；
绘制Kaplan-Merier 生存曲线，观察患者生存率。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 各组血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平，Hp 感染U 值比较 见表1。胃癌Hp 阳性组血清miR-101水平低于胃癌Hp 阴性组、对照组（t＝11.707，22.969，均P＜0.001），且胃癌Hp 阴性组低于对照组（t＝12.786，P＜0.001），HSP-70，IL-1β水平及Hp 感染U 值高于胃癌Hp 阴性组、对照组（t＝7.877，18.176；
6.445，11.817；
40.674，58.298，均P＜0.001），且胃癌Hp 阴性组高于对照组（t＝8.158，4.863，9.984，均P＜0.001），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平，Hp 感染U 值比较(±s)

表1 各组血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平，Hp 感染U 值比较(±s)

项目胃癌Hp 阳性组（n ＝68）胃癌Hp 阴性组（n ＝52）对照组（n ＝86）FP miR-1010.51±0.130.82±0.161.38±0.29317.051＜0.001 HSP-70（pg/L）2.73±0.691.80±0.571.14±0.38160.533＜0.001 IL-1β（ng/L）42.07±18.5423.61±10.3816.37±7.0979.650＜0.001 Hp 感染U 值（dpm/mmol）246.59±31.2859.26±12.6841.35±8.392 297.784＜0.001

2.2 Hp 感染与胃癌患者血清各指标水平关联性分析 Pearson 相关性分析显示，Hp 感染U 值与胃癌Hp 阳性组患者血清miR-101水平呈显著负相关(r=-0.629,P＜0.05)，与HSP-70，IL-1β水平呈显著正相关（r=0.574,0.539,均P＜0.05）；
Hp 感染U值与胃癌Hp 阴性组患者血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平无明显相关性（r=-0.237,0.198,0.174,均P＞0.05）。

2.3 胃癌Hp 阳性组不同血清指标水平患者组织中肿瘤增殖、侵袭基因表达比较 见表2。以胃癌Hp 阳性患者血清miR-101，HSP-70，IL-1β 水平平均数为界限，分为miR-101，HSP-70，IL-1β高水平、低水平患者。miR-101 高水平患者组织中PIK3CD，C-myc，EZH2，UHRF1，Vav3 基因表达量均低于低水平患者，HSP-70，IL-1β 高水平患者组织中上述各基因表达量均高于低水平患者，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。

表2 胃癌Hp 阳性组不同血清指标水平患者组织中肿瘤增殖、侵袭基因表达比较(±s)

表2 胃癌Hp 阳性组不同血清指标水平患者组织中肿瘤增殖、侵袭基因表达比较(±s)

组别miR-101 tP HSP-70 tP IL-1β tP高水平低水平高水平低水平高水平低水平n 313736323830增殖基因PIK3CD 2.27±0.58 3.62±0.70 8.554＜0.001 3.46±0.68 2.48±0.57 6.395＜0.001 3.39±0.73 2.51±0.61 5.330＜0.001 C-myc 1.58±0.32 3.29±0.54 15.489 ＜0.001 3.17±0.59 1.77±0.36 11.631 ＜0.001 2.98±0.51 1.91±0.40 21.755 ＜0.001 EZH2 1.28±0.39 3.47±0.62 17.034 ＜0.001 3.31±0.65 1.53±0.36 13.725 ＜0.001 3.09±0.58 1.68±0.43 11.114 ＜0.001侵袭基因UHRF1 1.44±0.43 3.15±0.49 15.146 ＜0.001 2.97±0.52 1.70±0.39 11.278 ＜0.001 2.84±0.47 1.77±0.41 9.853＜0.001 Vav31.19±0.36 2.84±0.45 16.467 ＜0.001 2.69±0.42 1.42±0.33 13.742 ＜0.001 2.52±0.48 1.55±0.31 9.594＜0.001

2.4 胃癌并发Hp感染患者血清各指标水平与组织中肿瘤增殖、侵袭基因表达关系 Spearman 相关分析可知，胃癌Hp 阳性患者血清miR-101水平与组织中PIK3CD，C-myc，EZH2，UHRF1，Vav3 基因表达量呈显著负相关（r=-0.664，-0.709，-0.714，-0.702，-0.687，均P＜0.05），HSP-70，IL-1β水平与组织中PIK3CD，C-myc，EZH2，UHRF1，Vav3 基因表达量呈显著正相关（rHSP-70=0.629，0.693，0.702,0.685,0.659 ；
rIL-1β=0.608,0.672,0.687,0.664,0.636，均P＜0.05）。

2.5 血清各指标与胃癌并发Hp感染患者生存期的相关性 见图1～3。随访至2021年2月，68 例胃癌并发Hp感染患者中共有3 例失访。经Kaplan-Meier 生存分析显示，HSP-70，IL-1β 高水平患者生存率均低于HSP-70，IL-1β 低水平患者，差异有统计学意义（χ2＝9.862，8.163，P＝0.002，0.004），miR-101 高水平患者生存率高于低水平患者，差异有统计学意义（χ2＝8.669，P＝0.003）。

图1 不同miR-101水平胃癌患者生存曲线

Hp 为一种存活在胃内的微生物，Hp 感染可导致细胞壁缺陷，提升黏附能力，逃脱免疫监视，引起胃黏膜慢性损伤，造成炎症反应与免疫反应，在胃癌发生、进展中起着重要作用[10-11]。进一步探讨Hp 促进胃癌进展的具体机制对胃癌及时、合理诊疗，改善患者预后具有积极意义。

图2 不同HSP-70水平胃癌患者生存曲线

图3 不同IL-1β水平胃癌患者生存曲线

IL-1β 为白细胞介素-1 主要存在形式与传导途径，KIM 等[12]研究报道，IL-1β 可与Hp 感染一同参与胃癌致病过程，Hp 根除后胃癌患者血清IL-1β水平可持续降低。本研究显示，胃癌Hp 阳性组血清IL-1β水平较高，且其水平与Hp 感染U值呈正相关。表明血清IL-1β和Hp 感染于胃癌病程进展中具有协同作用机制，Hp 感染可能会促进血清IL-1β 异常表达，促进胃癌发生、进展。分析原因可能为，Hp 经由感染活性氧簇途径促使NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3 炎症复合体激活，并促使Yes 相关蛋白-1 核易位，调节有关信号通路，促进IL-1β表达[13-14]。同时，IL-1β 高表达可刺激其他细胞因子与炎性因子分泌及释放，加快B 淋巴细胞增殖与分化，促进免疫球蛋白分泌，并可促使血小板生长因子、集落刺激因子形成与T 淋巴细胞激活，增强因细胞免疫引起的组织损伤，造成胃黏膜组织受损，促进胃癌发生、进展[15-16]。基于此，本研究生存分析显示，IL-1β 高水平胃癌Hp 阳性患者生存率较低。提示，IL-1β水平还与胃癌Hp阳性患者预后具有一定关系，通过测定其表达可为疾病诊治提供更多参考，利于增加患者临床获益。

HSP-70 为热休克蛋白家族中一员，付保芹等[17]研究报道，胃癌患者血清HSP-70表达可显著增高，且表达与Hp 感染有关。本研究发现，胃癌Hp 阳性组血清HSP-70水平较高，且其水平与Hp 感染U 值有关。提示血清HSP-70 可能与Hp 感染协同促进胃癌发生、进展。其原因可能为，Hp 感染可影响细胞毒素相关蛋白基因A表达，促使机体应激系统激活，进而影响血清HSP-70表达[18]。同时，相关研究报道，血清HSP-70表达增高可激活下游炎症反应，影响肿瘤微环境，引起肿瘤细胞生物学改变，增加癌细胞转移风险；
且能参与B 淋巴细胞瘤-2 基因等癌基因凋亡调控工作；
并可诱导Bcl-2相关的X 基因构象变化，阻止应激活化蛋白激酶诱导的Bcl-2 相关X 基因磷酸化，阻滞细胞凋亡；
同时，HSP-70表达升高可影响癌细胞中多聚蛋白沉积速度，提升癌细胞膜内侧第二信使激活程度，进而促进肿瘤浸润深度、临床分期进展；
此外，还可减弱胃黏膜上皮细胞基因错配修复能力，促进癌细胞上皮-间质转换，进而加速胃癌病情进展[19]。缪孟郡等[20]研究报道，有淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者血清HSP-70水平高于无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期患者，与肿瘤淋巴结转移、临床分期有关。本研究绘制生存曲线发现，HSP-70 高水平胃癌Hp 阳性患者生存率较低。也说明HSP-70水平与胃癌Hp 阳性患者预后有关，可为预后评价提供一定参考信息。

miRNA 可靶向调控有关基因表达参与肿瘤细胞分化、增殖与侵袭过程，在恶性肿瘤病程进展中起到致癌或抑癌作用[21]。miR-101 为一种具有抑癌作用的miRNA，黄光墉等[22]研究报道，胃癌患者miR-101表达可显著降低。本研究中，胃癌Hp 阳性组血清miR-101水平明显降低，且相关性分析可知，其表达与Hp 感染U 值呈负相关，绘制生存曲线提示，miR-101 高水平患者生存率高于低水平患者。说明血清miR-101 可能与Hp 感染协同促进了胃癌病程进展，影响患者预后，测定该指标水平可为临床制定合理治疗方案提供一定依据。考虑原因为，Hp 感染可促进细胞空泡毒素、尿素酶等物质分泌，增强对胃黏膜组织的刺激，加剧炎症反应与免疫系统激活程度，进而致使血清miR-101水平降低。同时，临床研究发现，miR-101 可抑制肿瘤细胞上皮-间质转化，降低细胞间黏附蛋白表达，抑制肿瘤细胞扩散与转移，miR-101表达降低可导致机体对肿瘤细胞增殖与转移抑制作用减弱，促进胃癌发病、进展[23]。

此外，PIK3CD，C-myc，EZH2 为调控细胞增殖过程促增殖基因，高表达与癌细胞恶性增殖有关。UHRF1，Vav3 为调控细胞侵袭重要基因，高表达可促进癌细胞侵袭过程。本研究显示，胃癌伴Hp感染患者血清miR-101水平与组织中上述肿瘤增殖、侵袭基因表达量呈负相关，HSP-70，IL-1β水平与组织中上述肿瘤增殖、侵袭基因表达量呈正相关。也提示Hp 感染可诱导血清miR-101，HSP-70，IL-1β 异常表达，促进肿瘤增殖、侵袭。在临床中应注意检测Hp 性质与miR-101，HSP-70，IL-1β表达情况，为胃癌诊治提供更多参考，改善患者预后。

综上，胃癌患者并发Hp感染可促进血清miR-101，HSP-70，IL-1β异常表达，促使肿瘤增殖、侵袭，影响患者预后。但本研究为单中心研究，仍有待将来多中心研究进一步探究。